响应面法优化β-环糊精辅助提取水飞蓟宾工艺

刘芳，瞿晓梅，赵婷，李紫嫣，刘玉璇，国大亮

天津中医药大学（天津 301617）

水飞蓟Silybum marianum（L.）是一种菊科水飞蓟属1年生或2年生草本植物[1-3]，水飞蓟素是从水飞蓟果实中提取出来的一种黄酮类物质，主要成分为水飞蓟宾[4-6]。其具有保肝[7-10]、抗癌[11-12]、抗菌[13]、抗血小板聚集[14]、抗炎和抗氧化[15]等药理作用。水飞蓟果实不仅具有较高的药用价值，其营养价值也很高，将水飞蓟宾加入到各种食品或饮料，制成保健食品或饮料，拓宽了水飞蓟宾的应用范围[16]。

β-环糊精（β-CD）具有外亲水内疏水的特殊结构，能够选择性包合难溶的药物成分，通过增加其溶解度提高中药有效成分的提取率[17]，在中药提取工艺上有着潜在的优势，因此得到越来越广泛的应用[18]。从水飞蓟中提取水飞蓟宾是此中药开发利用的重要环节，目前水飞蓟宾的提取方式有超声辅助有机溶剂提取[19-20]，碱提酸沉法[21]，超声辅助双水相体系提取[22]。试验通过β-CD辅助提取提高水飞蓟宾的提取率，以期在后续食品开发和工业生产中提供理论依据。

响应面法是利用中心组合试验拟合出二次多项式模型，通过回归分析寻找最优工艺参数[23]。试验以水飞蓟果实为原料，采用响应面法优化试验得出最佳提取工艺条件，从而提高水飞蓟宾得率。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与设备

Series III高效液相色谱仪（美国实验仪器公司）；UV-6100紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（常州朗越仪器制造有限公司）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-DⅢ循环水浴真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；KQ-250DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SQP电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.2 试验材料与试剂

水飞蓟宾对照品（≥98%，ChemFaces）；水飞蓟籽（安国市聚药堂药业有限公司，产品批号2008001）；β-环糊精[中国医药（集团）上海化学试剂公司]；甲醇（色谱纯，SIGMA-ALDRICH）、冰醋酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；其余试剂均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 水飞蓟宾含量测定分析方法的建立

1.3.1.1 含量测定方法

1.3.1.1.1 色谱条件的确定

色谱柱Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm）；流动相为甲醇-水-冰醋酸=48∶52∶1（V/V）；流速1 mL/min；检测波长287 nm；柱温采用室温[24]。

1.3.1.1.2 标准溶液的配制

精密称取10.08 mg水飞蓟宾对照品，置于50 mL容量瓶中加甲醇溶解制备成质量浓度0.201 6 mg/mL的标准储备液。

1.3.1.1.3 供试品溶液的配制

精密称取水飞蓟宾提取物，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声使其充分溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.3.1.1.4 紫外最大吸收波长的选择

以标准储备液为母液，精密吸取5 mL，置于10 mL容量瓶中，加色谱甲醇稀释至刻度，在200~400 nm进行全波长扫描。

1.3.1.2 含量测定方法学考察

1.3.1.2.1 线性关系考察

精密吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和5.0 mL水飞蓟宾对照品溶液，置10 mL量瓶中，加色谱甲醇稀释至刻度，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液按上述色谱条件进样测定。以峰面积y为纵坐标，浓度x为横坐标，进行线性回归，其回归方程为y=8 816.4x-9 505，R2=0.999 1。

1.3.1.2.2 精密度考察

取20 μL同一对照品溶液，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，水飞蓟宾对照品溶液SRSD=2.34%，表明高效液相仪器精密度良好。

1.3.1.2.3 稳定性考察

取同一份供试品溶液，分别于样品制备后0，2，4，6，12和24 h进样分析，SRSD=2.72%，说明稳定性良好，供试品溶液24 h内稳定性良好。

1.3.1.2.4 重复性考察

按照供试品溶液的配制方法，平行制备6份供试品溶液，注入高效液相色谱仪进样分析，SRSD=1.96%，表示重复性良好。

1.3.1.2.5 加样回收率考察

精密称取6份已知含量的供试品，按水飞蓟宾已知量的1倍加入对照品，同法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，计算加样回收率。

结果显示，水飞蓟宾对照品溶液平均回收率为100.4%，SRSD为1.65%，说明高相液相检测方法所测加样回收率结果可靠。

表1 水飞蓟宾加样回收率结果

1.3.2 响应面法优化水飞蓟宾提取工艺

1.3.2.1 水飞蓟宾的提取

将完整的水飞蓟籽粉碎过筛，加入一定量的β-环糊精，与一定量的溶剂混匀，在水浴锅上加热回流，将提取液过滤，旋转蒸发。

1.3.2.2 单因素试验

选取乙醇体积分数、料液比、β-环糊精加入量、提取时间4个因素作为自变量，水飞蓟宾提取量作为响应值。各因素的水平梯度设置：乙醇体积分数为0，30%，50%，70%和90%；料液比为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）；β-环糊精加入量为0，5%，10%，15%和20%；提取时间为1，2，3，4和5 h。根据试验结果选择主要影响因素，根据响应面法设计水飞蓟宾提取工艺，建立最优工艺。

1.3.2.3 Box-Behnken试验设计

在已有试验基础上，根据各因素对提取工艺的影响，选取料液比、β-环糊精加入量、提取时间为自变量，以水飞蓟宾提取量为评价指标进行星点设计试验，采用Design Expert试验设计软件进行试验。采用二次多项式拟合，建立方程式，根据最佳模型描绘响应面。试验因素及各水平值见表2。

表2 水飞蓟宾提取工艺响应面试验因素与水平

1.3.2.4 最优处方验证

根据Design Expert软件所给出的最优提取工艺预测各因素的最优值，测定水飞蓟宾提取量，与软件所给出的预测值对比，验证软件的准确性。

2 结果与分析

2.1 紫外最大吸收波长的选择

水飞蓟宾对照品在200~400 nm进行全波长扫描，结果在287 nm处有最大吸收，故选择287 nm为测定波长。

图1 水飞蓟宾全波长扫描图

2.2 HPLC色谱图（见图2）

图2 HPLC色谱图

2.3 单因素试验结果

2.3.1 乙醇体积分数对水飞蓟宾提取量的影响

由图3可知，随着乙醇体积分数增大，水飞蓟宾提取量随之增加，乙醇体积分数70%达到最大，乙醇浓度继续增大，水飞蓟宾提取量反而减小，可能是因为乙醇体积分数70%时，提取出的水飞蓟宾量达到饱和，继续增大乙醇浓度会将其他成分一并提取出来，造成水飞蓟宾提取量降低。因此，选择体积分数70%乙醇作为提取溶剂。

图3 体积分数对水飞蓟宾提取量的影响

2.3.2 料液比对水飞蓟宾提取量的影响

由图4可知，随着料液比增加，水飞蓟宾提取量随着增大，料液比1∶15（g/mL）时提取量达到最大，料液比继续增大，水飞蓟宾提取量反而减小，可能是随着料液比增加，其他水溶性物质也随着提取出来，造成水飞蓟宾提取量降低。所以，料液比选择1∶15（g/mL）作为响应面试验的中心点。

图4 料液比对水飞蓟宾提取量的影响

2.3.3β-环糊精加入量对水飞蓟宾提取量的影响

由图5可知，随着β-环糊精增加，水飞蓟宾提取量随之增加，β-环糊精加入量10%时提取量达到最大，随着β-环糊精继续加入，水飞蓟宾提取量降低。可能是由于β-环糊精的包合作用。故选择β-环糊精加入量10%作为中心点进行响应面试验。

图5 β-环糊精加入量对水飞蓟宾提取量的影响

2.3.4 提取时间对水飞蓟宾提取量的影响

由图6可知，随着提取时间延长，水飞蓟宾提取量随之增大，提取时间3 h时水飞蓟宾提取量达到最大，随着提取时间继续延长，水飞蓟宾的提取量反而降低，可能是随着时间延长，水飞蓟宾发生分解或提取出其他黄酮类物质造成提取量降低。故选择3 h作为提取时间中心点进行响应面试验。

图6 提取时间对水飞蓟宾提取量的影响

2.4 水飞蓟宾的提取工艺优化

2.4.1 响应面设计结果

运用Design-Expert 8.0.6对表3中试验结果进行多元线性回归及二项式拟合，得到二项式拟合方程：水飞蓟宾提取量=6.42+0.15A+0.29B+0.036C+0.24AB+0.60AC+0.12BC-0.87A2-1.14B2-0.20C2。

表3 水飞蓟宾提取工艺优化试验设计与结果

由表4可知，该模型p=0.000 1＜0.05，失拟项p=0.494 7＞0.05，说明该回归方程拟合性、可信度良好，显著性高，各试验点均能以模型描述。R2=0.986 4说明试验数据与模型相关性好，可用回归方程对水飞蓟宾的提取工艺过程进行预测和分析。分析各因素影响显著性发现，一次项C及交互项BC不显著，一次项A、B及交互项AB、AC，二次项A2、B2、C2均显著说明试验模型不是简单的线性关系，适合应用星点-响应面进行分析优化。

表4 回归方程方差分析

2.4.2 各因素交互作用响应面图（见图7~图9）

图7 料液比与β-环糊精加入量对水飞蓟宾提取量影响的等高线图与响应面图

图8 料液比与提取时间对水飞蓟宾提取量影响的等高线图与响应面图

图9 β-环糊精加入量与提取时间对水飞蓟宾提取量影响的等高线图与响应面图

2.4.3 提取工艺条件优化预测

运用Design-Expert 8.0.6软件优化所得的水飞蓟宾最优提取工艺预测为料液比1∶16.8（g/mL）、β-环糊精加入量11%、提取时间3.7 h。在此条件下预测水飞蓟宾含量为6.49 mg。

2.5 验证试验

按照响应面优化的最优条件进行验证试验，在其他因素固定不变的条件下，按照响应面软件所得到的最优提取工艺提取水飞蓟宾，测定的水飞蓟宾提取量依次为6.37，6.58和6.28 mg/g。水飞蓟宾提取量的预测值和实测值的相对误差在1.2%，说明试验所得数学模型可以较好的预测各因素和评价指标之间的关系，适用于该水飞蓟宾提取量的提取工艺优化。

3 结论

试验通过星点-响应面法优化β-环糊精辅助提取水飞蓟宾的工艺研究，运用Design-Expert对数据进行拟合，建立各影响因素与响应值的数学模型。确定的最优提取条件为料液比1∶16.8（g/mL）、β-环糊精加入量11%、提取时间3.7 h。最佳提取条件下预测水飞蓟宾提取量为6.49 mg/g。实测值与理论值总体吻合，说明模型能较好的预测响应值，优化条件可靠，具有实际应用价值。试验表明，β-环糊精能显著提高水飞蓟宾提取率，为后续水飞蓟宾的开发利用提供理论基础。