IL-17F基因rs763780位点多态性与川崎病的关联性分析①

胡娅南 刘 欣 贺 勤 胡 爽 申 琳 张 驰 李卓颖 杨作成

（中南大学湘雅三医院儿科，长沙410013）

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一种影响婴幼儿的中小型血管的炎性疾病，临床上又称皮肤黏膜淋巴结综合征［1］。KD 通常表现为发热、皮肤黏膜变化和淋巴结肿大，发病机制尚不清楚，部分病例预后并不理想［2］。有研究认为，KD 是由免疫功能障碍引起的急性血管炎，伴有细胞因子级联反应和内皮细胞病变。辅助性T细胞（T helper cell，Th）-17是一种可通过产生IL-17、IL-22 等细胞因子在自身免疫炎症发展中起关键作用的细胞亚群［3］。其中IL-17家族的成员A 和F 可作用于多种细胞，以诱导IL-6、TNF-α、IL-8、趋化因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等的表达，并可使组织炎症持续存在［4-5］。也有研究表明，KD 患者急性期血清IL-17 及其诱导的细胞因子水平明显增加［6］。彭茜等［7］研究表明，KD 与CD40、B 淋巴细胞激酶和 Fcγ 受体Ⅱα 基因、主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，HLA）的基因多态性有关［7］。目前未见 IL-17F 基因rs763780 位点多态性与KD 关联性的有关报道。为此，本研究探讨IL-17F 基因rs763780 位点多态性与KD 及其 KD 合并冠脉损伤（coronary artery injury，CAI）的关联性。

1 资料与方法

1.1 资料 选取2015 年至2018 年在湖南省中南大学湘雅三医院儿科住院治疗的100 例KD 儿童为KD 组，入选标准：①均符合 KD 的诊断标准［8］；②年龄范围为3 个月~8 岁；③入院前均未接受过丙种球蛋白和阿司匹林治疗。且按照心脏彩超的检查结果，根据有无合并CAI将KD 组进一步分为CAI亚组和非CAI 亚组（NCAI 亚组）。其中CAI 亚组的诊断指标［8］为：①≤3 岁患儿，冠脉内径>2.5 mm；②3 岁<患儿≤9 岁，冠脉内径>3 mm；③9 岁<患儿≤14 岁，冠脉内径>3.5 mm；④冠脉中有某一节段的内径是相邻段的1.5 倍以上；⑤管壁出现明显的不规则。选择同期在湖南省中南大学湘雅三医院儿童健康管理中心体检的100 例健康儿童作为对照组，入选标准：①年龄、性别和KD 组相匹配；②既往无KD 病史；③排除心血管疾病、风湿性疾病以及感染性疾病等。

以上两组研究对象均为汉族人群。所有入组儿童家长均已签署知情同意书，研究在中南大学湘雅三医院伦理委员会批准下进行。

入选 KD 组共 100 例，其中男 64 例，女 36 例，平均年龄（3.4±1.8）岁；对照组共100例，其中男60例，女40 例，平均年龄（3.8±1.9）岁。两组儿童的性别和年龄相比较，差异均无统计学意义（P均>0.05），组间有可比性。临床资料显示，100%的KD 组患儿有发热表现，口唇充血皲裂、“杨梅舌”及颈部非化脓性淋巴结肿大是出现较多的临床症状。100 例KD 组中有22 例患儿发生冠状动脉扩张。KD 组临床资料见表1。

表1 KD组患儿临床资料Tab.1 Clinical data of KD

1.2 方法

1.2.1 标本采集及基因组DNA 提取 取得入组儿童家属同意后，EDTA 抗凝采血管采集各组患儿静脉血标本3 ml。依照北京全式金生物技术有限公司的核酸纯化试剂盒（BloodZol）说明书，对基因组DNA 进行提取。经分光光度（紫外吸收）法检测DNA纯度和浓度后，于-80℃保存。

1.2.2 IL-17F 基因多态性检测 基因扩增-聚合酶链限制性长片段法（PCR-RFLP）检测IL-17F 基因rs763780 位点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP），引物由湖南擎科生物技术有限公司合成。IL-17F/rs763780 位点引物序列：引物F：5'-CCATCCGTGCAGGTCTTATT-3'，引物R：5'-ATGCCTCACCATTGTGCTTT-3'。 PCR 反 应 体 系 为25 μl 体系，条件为：①94℃，5 min；②（94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，30 s）×35 个循环；③72℃，10 min。行PCR 扩增后，其产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。直接测序法测定目的基因序列：检测目的基因片段存在后，送往上海铂尚生物技术有限公司进行测序，使用SnapGene软件分析测序结果。

1.3 统计学分析 数据分析使用SPSS20.0 软件，计量资料均以表示，计数资料使用χ2检验，各组IL-17F基因rs763780位点基因型和等位基因频率采用直接计数法统计，以P<0.05 为差异有统计学意义。各基因型频率的遗传平衡性采用遗传平衡定律（又称Hardy-Weinberg 定律）检验，P>0.05 表示样本具有群体代表性。采用在线SHEsis 软件进行IL-17F基因位点的连锁不平衡和单倍型分析。

2 结果

2.1 IL-17F/rs763780 位点片段PCR 产物扩增结果 经检测，基因组DNA 的OD260/OD280均在1.7～2.0 范围内，符合要求。经琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，IL-17F基因 rs763780 位点 PCR 产物片段长度为405 bp，与预期结果一致，见图1。

图1 IL-17F基因rs763780位点PCR扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of locus IL-17F rs763780

2.2 IL-17F基因rs1889570 位点基因型和等位基因频率分布 两组的基因型频率经Hardy-Weinberg定律检验，χ2值为2.040 8 和0.001 1，P均>0.05，表明样本选取有群体代表性。通过直接测序法检测多态性位点的基因型，SnapGene 软件分析测序结果，IL-17F基因rs763780位点存在的基因型有3种，分别为TT、TC和CC，见图2。

图2 IL-17F基因rs763780位点PCR产物测序图Fig.2 Direct sequencing graph of PCR products of locus IL-17F rs763780

在 rs763780 位点，KD 组和对照组均有 TT、TC和CC 三种基因型，且两组的基因型频率分布顺序由高到低均为TT 型、TC 型、CC 型。两组的基因型频数分布及T、C 等位基因频率相比较，差异均无统计学意义（χ2=2.21、0.92，P均>0.05）。CAI 亚组在rs763780 位点有 TT、TC 和 CC 三种基因型，而 NCAI亚组仅有TT、TC 两种基因型。但CAI 亚组与NCAI亚组比较，基因型频数分布的差异无统计学意义（χ2=3.85，P>0.05），且T、C 等位基因频率的差异亦无统计学意义（χ2=1.07，P>0.05），见表2。

表2 各组中IL-17F基因rs763780位点多态性的基因型分布及等位基因频率比较［n（%）］Tab.2 Comparison of genotype distribution and allele frequency of locus IL-17F rs763780 polymorphism in each group［n（%）］

3 讨论

KD 是一种与心血管后遗症相关的急性系统性血管炎。目前认为KD 与多基因相关，并可在急性期患者体内观察到血清中的细胞因子含量显著升高［2，9］。SNP 的变化可影响蛋白质的表达及功能，继而导致个体对于某些疾病的易感性出现变化［10］。现已确定了大量细胞因子的多态性与KD 易感性的关联性，并在相关研究中发现与KD患者发生CAI的风险增加相关的基因，包括IL-10 启动子的多态性、MMP-13 基因的功能多态性、炎症基因CRP 的多态性和TNF-α基因等［11-14］。

IL-17 是由 Tc17 细胞、NKT 细胞和 Th17 细胞等多种细胞群体产生的，因其在自身免疫中发挥的促炎作用而备受关注［15］。IL-17F 和 IL-17A 的细胞来源和功能相似，且有研究提示IL-17F 的功能可能比IL-17A 更重要［15-17］。有研究报道 KD 患儿的血清 IL-17 水平明显增加［6，18］，但目前尚未对 IL-17F 基因与KD 的关联性进行研究。本研究中rs763780 位点位于IL-17F 基因的3'编码区，此位点的碱基发生突变会导致IL-17F 基因编码的氨基酸出现替换改变，从而影响其蛋白质功能。

本研究未发现IL-17F 基因的rs763780 位点多态性与KD 存在关联性，并且亦未发现其与KD 合并的CAI相关联。但基于KD的遗传复杂性，仅使用单基因位点分析和解释KD 的发病具有一定的局限性，在未来的研究中或可进行多中心大样本临床研究来进一步分析，以期更好地对KD 人群发病风险及预后状态进行更好的判断。