改良处理低温甘油保存的羊膜对兔角膜碱化学伤后上皮修复作用的研究

吴丹 黎玥 吴复跃 项俊 徐建江

（1.复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 上海 200031；2.上海睿泰生物科技股份有限公司 上海 201114）

羊膜因其促上皮化，抑制炎症反应及纤维化的两大特点，在眼表重建方面得到广泛应用[1-2]，其适用范围包括持续性角膜上皮缺损，眼表酸、碱化学性烧伤、热灼伤，角膜溃疡等[3]。

新鲜羊膜因保存时间短、保存条件要求较高，眼科专科医院取材受到一定限制，同时作为移植的生物样本，存在微生物交叉感染的可能性，其临床应用受到一定限制。低温保存羊膜与新鲜羊膜相比，其基本结构相同[4-5]，因其克服了保存不便及可能携带病原微生物的问题[6],因此在临床上逐渐受到广泛应用。改良处理低温甘油法保存羊膜，是用胰酶及核酸酶处理脱基质细胞及DNA、乙醇及伽马射线照射灭活病原微生物，以甘油作为稳定剂，在低温保存中起到对羊膜的保护作用。本研究采用改良处理低温甘油法保存的羊膜，以角膜碱化学伤兔作为研究模型，研究此羊膜对兔眼表碱化学伤后上皮的修复作用，探讨其治疗的有效性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 3～5个月龄健康新西兰兔30只（雌性，2～2.5 kg，购于上海中科院实验动物研究所）。

1.2 实验方法 改良处理低温甘油羊膜的制备过程均在无菌条件下进行，其制作步骤简述如下。

（1）羊膜剥离清洗、固定：从胎膜边缘缓慢剥离羊膜层，用镊子侧面剥离羊膜毛面凝胶状物质，用无菌注射用水清洗羊膜2～3次；将羊膜光面向上，平铺在浸润于无菌注射用水的格栅膜上，排除气泡，用6-0线沿羊膜四周缝合固定。

（2）酶处理：根据羊膜面积计算2 000 u/mL TrypLE处理液用量，将羊膜面向下置于TrypLE处理液中，37 ℃震荡30 min,生理盐水清洗5次。

（3）渗透压处理：根据羊膜面积计算无菌注射用水用量，将羊膜面向下置于无菌注射用水中，2～8 ℃ 放置过夜。

（4）核酸酶处理：配置INDUMY nuclease处理液，根据羊膜面积计算INDUMY nuclease处理液用量，将羊膜面向下置于INDUMY nulease处理液中，37 ℃震荡3 h；继而用生理盐水清洗5次。

（5）乙醇病毒灭活：将羊膜面向下放入70%乙醇溶液中进行病毒灭活（37 ℃，30 min）；继而用生理盐水清洗5次。

（6）裁剪：将羊膜剪裁成合适大小，连同格栅膜放入羊膜夹具中，置入含甘油的塑料容器；2～8 ℃过夜，进行脱水；脱水后的羊膜（置于夹具中）放入羊膜包装盒中，加入适量甘油，热封。

（7）伽马射线辐照灭菌：伽马射线照射（25 KGy）灭菌。

1.3 手术方法 所有实验步骤均满足复旦大学附属眼耳鼻喉科医院动物实验伦理学要求。设置左眼为造模眼。新西兰兔按1 mg/kg氯胺酮联合15 mg/kg甲苯噻嗪肌注麻醉后，术眼使用0.4%盐酸奥布卡因滴眼液进行表面麻醉。将直径为8.5 mm的角膜负压环钻通过负压作用吸附于兔角膜表面，取0.5 mL浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液滴入负压环钻内20 s，继而用大量林格液冲洗。去除负压环钻后，再用林格液彻底冲洗角膜。造模结束后角膜中央损伤区呈现均匀一致的瓷白色，确认造模成功。选取造模成功的新西兰兔用于实验。

将角膜碱化学伤兔随机分为2组，每组15只。A组为实验组：化学伤眼使用改良处理低温甘油法保存的羊膜进行角膜覆盖术。B组为空白对照组：化学伤眼不进行羊膜覆盖术。手术方法简述如下：将羊膜平整地覆盖于眼表，使用10-0尼龙线行间断缝合8针，将羊膜固定于距角膜缘2 mm处的浅层巩膜上，缝合结束后修剪去除多余羊膜。局部使用氧氟沙星滴眼液滴眼（3次/d）至实验结束。

1.4 观察指标 分别于术后3、5、7、10、14 d，于裂隙灯显微镜下观察2组碱化学伤兔的眼表情况，记录结膜囊有无分泌物、羊膜是否在位等一般情况。随后，各组随机选取3只造模兔，拆除其眼表羊膜，行眼前节拍照及角膜上皮荧光素钠染色，记录上皮缺损范围，使用Image J软件在前节照中圈出角膜上皮缺损区域，获得相应的像素面积后，换算为其实际面积。继而用空气栓塞法处死新西兰兔，沿角膜缘取下角膜，用4%多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、切片、染色后行组织病理学观察。

1.5 统计学处理 数据统计采用SPSS 13.0软件，计量资料以均数±标准差表示，采用成组t检验比较对照组与实验组的组间差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 改良处理低温甘油法保存的羊膜外观透明性好，与新鲜羊膜的对比如图1A、B。羊膜的苏木精-伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色及扫描电镜检测如图1C、D，可见羊膜上皮面致密的纤维网状结构，未见细胞结构。羊膜柔软与眼表贴合性好，抗拉伸强度0.3～0.4 Mpa。经检测羊膜无细菌、病毒、支原体等微生物，无甘油残留，其安全性好，满足眼表手术要求。

图1 改良处理低温甘油法保存的羊膜外观照及组织电镜照 A.改良处理低温甘油法保存的羊膜；B.新鲜羊膜。改良处理低温甘油法保存的羊膜外观透明度好，与新鲜羊膜相比无明显差别。C.改良处理羊膜的HE染色；D.改良处理羊膜的扫描电镜照片，可见羊膜上皮面致密的纤维网状结构，未见细胞结构。

碱化学伤造模后兔角膜水肿，呈灰白色。A组与B组造模后即刻角膜上皮缺损情况相当，术后各观察时间点见造模眼结膜充血，角膜呈瓷白色混浊。各观察点A组均无羊膜溶解、脱落。A组术后3 d即有2只兔眼角膜上皮完全愈合，B组于术后14 d角膜上皮仍有不同程度的缺损（图2）。术后14 d时，2组兔角膜基质浑浊程度未得到改善。

图2 兔角膜碱化学伤后前节照 A、E、I、M和Q分别为A组造模后3、5、7、10、14 d的眼前节照。B、F、J、N和R分别为A组造模后3、5、7、10、14 d的眼前节钴蓝光照。C、G、K、O和S分别为B组造模后3、5、7、10、14 d的眼前节照。D、H、L、P和T分别为B组造模后3、5、7、10、14 d的眼前节钴蓝光照。

2.2 角膜荧光素染色面积 A组和B组于术后3、5、7、10、14 d的角膜上皮平均缺损面积见表1。造模后3～10 d，A组与B组角膜上皮平均缺损面积差异无统计学意义（P＞0.05）。造模后14 d，A组角膜上皮缺损面积小于B组，差异有统计学意义（t=-3.371，P=0.028）。

表1 不同时间点兔角膜上皮平均缺损面积 单位：mm2

2.3 组织病理学观察 组织病理学观察示A组羊膜覆盖术后3 d可见完整的角膜上皮，其结构仅为单层上皮细胞，上皮与基质连接不紧密。B组于造模后 3 d中央角膜上皮缺失，基质裸露。A组羊膜覆盖术后5 d，角膜上皮与基质不紧密，部分脱离。B组于造模后5 d角膜表面可见脱离的上皮。A组羊膜覆盖术后7、10、14 d可见完整的复层角膜上皮，基质内伴有炎症细胞浸润。B组于造模后7、10、14 d角膜上皮仍有部分缺失，上皮覆盖区与基质连接不紧密，部分脱离（图3）。

图3 兔角膜碱化学伤后光镜下角膜的组织HE染色（×100）A.羊膜覆盖术后3 d可见完整的角膜上皮，仅为单层上皮细胞，上皮与基质接连不紧密。B.B组于造模后3 d中央角膜上皮缺失，基质裸露。C.羊膜覆盖术后5 d，角膜上皮与基质不紧密，部分脱离。D.B组于造模后5 d角膜表面可见脱离的上皮层。E、G和I分别为羊膜覆盖术后7、10、14 d，可见完整的复层角膜上皮，基质内见炎症细胞浸润。F、H和J分别为B组造模后7、10、14 d，可见角膜上皮仍有部分缺失，上皮覆盖区与基质连接不紧密，部分脱离。

3 讨论

眼表碱化学伤是以碱性物质为主的化学物质所致的腐蚀性眼表损伤。眼表受化学物质损伤后，角结膜上皮细胞及基底膜受损，角膜缘及结膜缺血坏死，眼表微环境恶化，导致角膜缺氧、营养障碍和剧烈的炎症反应，可诱导角膜新生血管生成，形成血管化角膜、睑球粘连，是我国严重的致盲性眼病。

在化学性烧伤的眼表重建中，羊膜移植疗效显著[7-8]。羊膜是富含胶原的无血管基底膜，与角结膜结构相似[9-10]。羊膜可提供上皮下基质微环境，同时分泌碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）等多种生长因子[11]，有利于角膜上皮细胞增殖、移行，抑制上皮细胞凋亡。此外，羊膜可刺激角膜缘干细胞生长，缩短角膜上皮的愈合时 间[7,12]；其物理性的屏障作用，可保护新生的角膜上皮免受瞬目时眼睑的切线力影响，利于眼表上皮化。此外，羊膜含有多种蛋白酶抑制剂，可调整趋化因子表达，诱导炎性细胞凋亡，从而减轻角膜炎症反应、抑制新生血管形成及角膜溶解，减少瘢痕增生[8,13]，防止化学伤后睑球粘连，达到修复和重建眼表的目的[14]。

在羊膜选择方面，主要有新鲜羊膜和冻干羊膜。新鲜羊膜虽然效果好，但保存时间短、保存成本较高，眼科专科医院取材受到一定限制；同时，虽然羊膜取自感染指标阴性的供体，但某些微生物感染存在窗口期，移植新鲜的羊膜存在感染的风险。各家医院在处理羊膜时参照了角膜的处理方法，无规范统一的质控标准，导致最终羊膜质量参差不齐。处理过程中仅使用几种抗生素浸泡羊膜也很难避免微生物的残留。以上诸多原因限制了新鲜羊膜的临床应用。现今医院大多采用低温甘油保存法来延长羊膜的保存期限。低温甘油保存羊膜是将羊膜保存于一定比例的甘油/培养基混合液或纯甘油 中[1]，于-85～-75 ℃下可保存1～2年[15]。有研究[16-17]表明低温甘油保存的羊膜在降低翼状胬肉复发率、治疗持续性角膜上皮缺损中与新鲜羊膜相比差异无统计学意义。

本研究采用改良处理低温甘油法保存的羊膜，使用乙醇及伽马射线照射（25 KGy）2种方法联合灭活病原微生物，有效地保证羊膜的安全性。同时，胰酶及核酸酶的脱细胞、除去DNA处理提升了羊膜透明度，减少其可能存在的免疫原性。此外，湿态冷藏保存羊膜，保持了其新鲜度和柔韧性。虽然该处理方法步骤较多，但在使用中羊膜与眼表贴合性好，可减少局部异物感，有助于患者术后视力的恢复，且克服了冻干羊膜脆性大、韧性较差、容易撕裂的弊端。

本研究采用改良处理低温甘油保存的羊膜，观察其对兔角膜碱化学伤后上皮的修复作用，取得较满意的效果。根据文献[18]报道，兔角膜碱化学伤后48 h角膜上皮可完全修复，但已修复的角膜上皮容易脱落。在本研究中造模后第3天仅A组观察到兔角膜上皮完全修复，B组未观察到兔角膜上皮完全修复，可能是因为本研究中兔角膜上皮损伤面积较大，上皮完全修复更为困难。HE染色结果显示造模后3 d，兔角膜中央仅形成了单层的角膜上皮，并且上皮细胞与基质层之间的连接并不紧密，说明兔角膜上皮损伤早期形成的上皮层容易再次脱落造成角膜上皮的缺损。虽然在造模后3、5、7、10 d，2组间平均角膜上皮缺损面积差异无统计学意义，但在14 d时2组间平均角膜上皮缺损面积差异有统计学意义。此时HE染色结果显示A组形成复层的角膜上皮结构，且上皮与基质之间连接紧密，而B组形成的角膜上皮厚度不一，且上皮与基质之间连接不紧密，易造成角膜上皮脱落。在角膜HE切片制作过程中也可能造成角膜上皮的缺失，但脱落的上皮一侧可能仍会与角膜相连或游离于裸露的基质附近。本研究中，大部分角膜上皮缺失的图像中未见到游离的角膜上皮；同时，造模后角膜荧光照也说明存在兔角膜上皮的缺失。这2个结果互相补充，说明碱烧伤后角膜上皮的缺失及低温甘油保存的羊膜对其存在修复作用。虽然组织病理学的研究结果属于描述性结果，但组间观察期内的病理切片可说明低温甘油保存的羊膜对兔角膜碱化学伤后上皮修复有较好的促进作用。此外，术后14 d时，2组兔角膜基质浑浊程度均未得到改善，可能与观察时间较短有关。

本文的不足之处：角膜新生血管范围是评价眼表化学伤恢复的指标之一，该研究未将新生血管范围的比较纳入研究结果。因为角膜新生血管的比较需分辨率较高的照片；而目前市面上用于兔麻醉的药物选择很少，且一直处于缺药断货的状态，麻醉药物作用的较浅，使兔眼无法充分暴露，无法进行角膜周边新生血管的统计。此外，本研究中使用的羊膜，是在既往羊膜的低温甘油保存法上做了优化改良，是升级产品。这种处理保存方法为首次报道，但只与空白对照组进行了对比，与其他新鲜羊膜的疗效对比，有待进一步研究。

综上所述，改良处理低温甘油保存的羊膜能促进眼表化学伤的修复；同时，其易于保存、运输、使用方便且不存在微生物交叉感染的可能性，值得在眼表重建中推广应用。