射阳湖水环境现状与沉积物氮循环功能基因研究

郑 浩，樊祥科，钟 非，高海优，张晓倩，李博文，张朝晖，张永江

(1.江苏省渔业技术推广中心，江苏 南京 210036；2. 南通大学生命科学学院，江苏 南通 226019)

为加强水产种质资源及其生存环境的保护，近年来农业农村部积极推进水产种质资源保护区建设工作，已审定公布11批535处国家级水产种质资源保护区。在保护区内，除了采取禁捕措施以外，还需要为水生生物的生存繁衍提供适宜的生存环境[1]，包括丰富的天然饵料和优良的水环境等。目前，有关水产种质资源保护区的研究主要集中在浮游动物群落调查和水环境质量评价两个方面。梁正其等[2]基于锦江河国家级水产种质资源保护区浮游动物群落特征数据，评估了生物饵料资源现状。罗建波等[3]对梁子湖、鄱阳湖和千岛湖国家级水产种质资源保护区的富营养化状况进行评价，发现3个保护区整体处于中营养状态。刘凯等[4]调查了嬉子湖国家级水产种质资源保护区浮游动物群落特征和水环境质量状况，探讨了影响浮游动物群落组成的关键环境因子，并指出总氮是决定该水域所属环境质量类别的关键指标。

射阳湖水域于2011年被列为国家级水产种质资源保护区(第4批)。然而，保护区内相关水环境基础数据缺乏，仅有少量历史数据资料，难以支撑保护区水产种质资源养护工作的开展。为避免出现重建轻管、只建不管的状况，有必要系统开展射阳湖保护区水环境质量现状调查。此外，底泥基本理化性质和氮循环微生物特征调查也亟待开展。底泥在水生态系统中充当着“源”或“汇”的双重角色：外源输入的氮素除了被水生生物吸收利用，还会通过物理、化学及生物作用沉降至水体底部；底泥中富集的氮素在一定条件下又会向上覆水释放，对水环境质量造成影响[5-6]。同时，底泥还是微生物的天然载体，由底泥中微生物驱动的氮循环在维持湖泊生态平衡中发挥重要作用[7]。氮循环微生物参与了氨化、硝化和反硝化等生态过程，上述过程影响了水生态系统中氮的转化和去除[8]。通过调查氮循环功能基因丰度，有利于掌握射阳湖保护区氮素的生物地球化学循环过程。另外，董志颖等[9]报道外源性氮素输入可直接影响寡营养水体中氮循环功能基因丰度，因此，氮循环功能基因丰度可能对外源性氮素输入具有一定指示作用。笔者研究在射阳湖保护区共布设11个站位，分析主要水体理化指标的时空变化规律，同时在核心区中心及外围区域(共5个站位)开展底质及微生物群落现状调查。采用实时荧光定量PCR技术，调查各站位底泥中氮循环细菌功能基因丰度的季节变化规律，并结合水质和底质调查结果，分析氮循环功能基因间及其与射阳湖水域主要环境指标间的相关关系。笔者研究将有助于全面了解射阳湖国家级水产种质资源保护区水质和底质状况，以及氮循环微生物特征，并为保护区后续水环境管理和整治工作提供重要基础数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究水域与样品采集

射阳湖国家级水产种质资源保护区位于江苏省扬州市宝应县东郊，保护区是由4个拐点(33°16′35″ N，119°39′22″ E；33°16′15″ N，119°36′28″ E；33°19′53″ N，119°31′45″ E；33°20′14″ N， 119°37′41″ E)顺次连线围成的水域，总面积为666.7 hm2。其中，核心区面积为100 hm2，为由5个拐点(33°18′42″ N，119°37′20″ E；33°18′31″ N， 119°37′31″ E；33°18′34″ N，119°37′12″ E；33°18′45″ N，119°37′09″ E；33°18′57″ N， 119°37′12″ E)顺次连线围成的水域(图1)。

射阳湖保护区河网发达，周围分布有安丰河、走马河、大三王河、杨家河和鸽子河等河流。保护区核心区靠近村镇，且周边水产养殖业和种植业发达。根据保护区现状，在核心区外围(S1～S6)和核心区内(S7～S11)共布设11个站位。在核心区外围，S1、S5和S6站位靠近村镇，而S2、S3和S4站位靠近农业区；在核心区与各条支流交界处分别设置S7～S10站位，S11站位位于核心区中心。分别于2018年5月(春季)、8月(夏季)、11月(秋季)和2019年2月(冬季)，开展射阳湖水域水体与沉积物环境质量现状调查。调查期间，分别从11个站位采集水样，同时选择S1、S2、S3、S4和S11共5个站位(由于底泥疏浚，S5站位未采集到底泥样品)，使用抓斗式底泥采样器对 0～10 cm表层沉积物进行采集，每个站位采集 3个混合样，混合后分为两份封装，并分别经冷藏和冷冻带回实验室用于后续理化和微生物分析。

1.2 理化指标测定

采用EXO多参数水质监测仪(YSI EXO2)现场测定水体温度(T)、pH值、溶解氧(DO)和叶绿素(Chl a)浓度。采用自动化学分析仪(CleverChem anna)测定水样中氨氮(NH4+-N)、硝酸盐氮(NO3--N)、亚硝酸盐氮(NO2--N)和正磷酸盐(PO43--P)浓度。使用ArcGIS 10.2软件，采用插值法绘制NH4+-N、NOx--N和PO43--P浓度时空分布图。水体总氮(TN)、总磷(TP)和高锰酸盐指数(CODMn)检测参照《水和废水监测分析方法》[10]。另外，取新鲜底泥10.0 g放入100 mL三角瓶，加入2 mol·L-1KCl溶液50 mL，用橡皮塞塞紧，振荡30 min，过滤后使用自动化学分析仪测定浸出液中NH4+-N浓度。风干后的底泥样品中全碳、全氮和全硫含量使用元素分析仪(Elemantar vario)检测。

1.3 样品基因组总DNA提取和PCR扩增

使用E.Z.N.A.®soil DNA Kit(Omega Bio-tek)试剂盒提取底泥样品基因组DNA，用质量浓度为10 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳检测抽提DNA的完整性，并用NanoDrop 2000 分光光度计(Thermo Scientific)检测DNA浓度和纯度。

用引物分别扩增细菌16S rDNA和氮循环细菌功能基因(AOB-amoA、nxrA、narG、nirK、nirS和nosZ)，qPCR扩增引物见表1。

表1 该研究所用扩增引物

qPCR反应采用20 μL体系，包括10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)、20 μmol·L-1上下游引物、2 μL模板DNA(6～10 ng)以及7.6 μL灭菌超纯水。将PCR产物回收，连接至pMD18-T载体(TaKaRa)，转化至大肠杆菌DH5α感受态中，筛选阳性克隆，提取各基因重组质粒，用NanoDrop 2000 分光光度计测定质粒浓度，计算各基因拷贝数，按10倍梯度稀释备用，制作标准曲线。若标准曲线斜率在-3.5～-3.0范围内，则继续开展后续样品测试。采用SYBR Green定量PCR法测定各基因拷贝数，荧光定量PCR反应在ABI7500荧光定量PCR仪(ABI)上进行，每个样品设置3个平行样，验证检测重复性及可靠性。

1.4 统计分析

采用SPSS 19.0软件，对水体理化指标监测值及氮循环功能基因拷贝数在不同季节间的差异显著性进行分析，并对不同功能基因间及功能基因与主要环境因子间进行Pearson相关性分析。

2 结果与讨论

2.1 水环境质量现状

2.1.1水质季节变化

参照GB 38382—2002《地表水环境质量标准》，由水体理化指标监测结果(表2)可知，射阳湖保护区冬、春季水体TN浓度符合Ⅴ类标准要求，秋季水体TN和TP浓度均符合Ⅳ类标准要求；夏季水体TP浓度达到(0.21±0.13) mg·L-1，若参照湖、库标准，则水质为劣Ⅴ类，如果将射阳湖水域视为河网，则水质符合Ⅳ类标准要求。氮、磷浓度是决定该水域水质所属类别的关键指标。冬季水体TN浓度最高，且显著高于秋季和夏季(P<0.05)；而夏季水体TP浓度最高，且显著高于秋季和春季(P<0.05)。参考《湖泊(水库)富营养化评价方法及分级技术规定》，射阳湖保护区4个季节综合营养状态指数(TLI)分别为53.5(秋)、54.9(冬)、59.8(春)和57.6(夏)，存在轻度富营养化问题。

春季射阳湖保护区水体pH值和Chl a浓度显著高于其他季节(P<0.05)，说明浮游植物生物量较高。朱英等[11]指出夏季水温较高，光照充足，而且暴雨径流进入上海大莲湖后，导致水体N、P浓度升高，从而诱发浮游植物生长，使得夏季部分湖区藻密度高于其他季节。笔者研究中夏季水体Chl a浓度低于春季，可能与射阳湖保护区夏季水体N/P比值较低[12]和水面浮叶植物生物量较高[13]有关。此外，春季小型硅藻大量繁殖[14]也可能是射阳湖保护区水体Chl a浓度在春季偏高的原因之一。

表2 调查水域不同季节水体理化指标均值

2.1.2水质空间变化

为探明射阳湖保护区氮、磷污染源头，对水体NH4+-N、NOx--N(NO2--N和NO3--N浓度之和)和PO43--P浓度进行空间插值分析。由图2可知，不同季节水体氮、磷浓度空间分布存在一定差异。秋季S3和S8站位水体ρ(NH4+-N)分别为0.89和0.68 mg·L-1，高于其他站位；由于两个站位所处河流(走马河)两岸水产养殖池塘较多，养殖收获季节清塘废水排放[15]可能是局部水体NH4+-N浓度较高的主要原因。

冬季S5、S7和S11站位水体ρ(NH4+-N)分别为0.96、1.74和0.97 mg·L-1，高于其他站位；3个站位所处河流(大三王河)为射阳湖水域的主要河道，除了河道紧邻的射阳湖镇污水排放输入外，枯水期上游NH4+-N污染输入[16]可能也是导致保护区水域NH4+-N浓度升高的原因之一。春季S5和S6站位水体NH4+-N浓度较高，村镇污水排放输入[17]可能是主要原因。夏季S1、S6和S9站位(安丰河)水体NH4+-N浓度较高，同时S1和S6站位水体ρ(PO43--P)异常偏高，分别为0.27和0.35 mg·L-1，村镇地表径流输入与上游河流输入可能是该河段氮、磷浓度偏高的主要原因。在秋、冬季，NOx--N浓度均处于较低水平；而春季S2、S9和S11站位水体ρ(NOx--N)超过0.30 mg·L-1，夏季S8和S10站位水体ρ(NOx--N)分别为0.49和0.78 mg·L-1。上述点位大多位于射阳湖保护区核心区，春、夏季NOx--N浓度偏高可能与东侧农业面源污染有关[18]。射阳湖保护区河网复杂，为从源头上防治污染，需要进一步调查水体流向，并做好村镇污染输入截留与水产养殖转型升级等工作，确保核心区水质逐年提升。

2.2 沉积物环境质量现状

除了外源污染输入外，底泥中内源污染释放也可能造成上覆水体富营养化[19]。射阳湖水域4个季节底泥中全碳、全氮和全硫含量最高值大部分出现在S1和S3站位(图3)。S1站位所处河段位于村镇一侧，底泥淤积严重，春、夏季底泥中全碳、全氮和全硫含量均高于其他站位。S3站位所处河段两侧分布有大量水产养殖池塘，冬季底泥中全碳、全氮含量和秋季底泥中全硫含量高于其他站位。村镇污水排放和农业污染输入可能分别是S1和S3站位底泥污染物积累的主要原因。除S1站位外，其他站位春、秋季底泥全氮含量均低于冬、夏季。此外，春季各站位底泥浸出液中NH4+-N浓度均值〔(7.49±1.89) mg·L-1〕显著低于其他3个季节〔秋季，(16.56±6.09) mg·L-1；冬季，(14.70±2.28) mg·L-1；夏季，(12.91±3.57) mg·L-1〕。由于冬季水体溶解氧浓度较高，同时S2、S3和S4站位底泥中全氮含量处于4个季节最高水平，底泥中有机氮氧化引起的内源释放可能是水体NH4+-N浓度升高的主要原因之一。在S3和S4站位(分布在农业种养殖区一侧)4个季节底泥全硫含量变化不大，均处于较高水平；在S1、S2和S11站位(分布在射阳湖镇一侧)，秋季底泥全硫含量明显低于其他季节。特别是在S1站位，春、夏季底泥全硫含量明显升高，且底泥全碳和全氮含量也处于较高水平，容易引发水体黑臭，需要进行河道清淤。

2.3 微生物群落氮循环功能基因

在不同形态氮素的相互转化过程中，氨单加氧酶(AMO)、羟氨氧化还原酶(HAO)、亚硝酸盐氧化还原酶(NXR)在硝化过程中发挥着重要作用，而在反硝化过程中硝酸还原酶(NAR)、亚硝酸还原酶(NIR)、一氧化氮还原酶(NOR)和氧化亚氮还原酶(NOS)可催化相关反应[20]。射阳湖保护区各站位底泥氮循环细菌功能基因(nosZ、nirS、nirK、narG、nxrA和AOB-amoA)拷贝数及其占细菌16S rDNA拷贝数比例的季节变化见图4。S1站位春、秋季氮循环功能基因拷贝数及其占细菌16S rDNA拷贝数比例均高于冬、夏季，其中，春季S1站位各氮循环功能基因拷贝数总和远高于其他季节和站位。冬季S3站位氮循环功能基因拷贝数虽然低于S2和S4站位，但氮循环功能基因占细菌16S rDNA比例在5个站位中最高。在春、冬两季调查中，底泥全氮含量最高的站位分别是S1和S3，说明氮循环细菌功能基因拷贝数及其占细菌16S rDNA比例对底泥氮污染状况具有一定指示作用。

春季各站位nosZ、narG和nirK基因丰度均较高，其中，nosZ和nirK基因丰度显著高于其他季节(P<0.05)。同时，春季各站位nosZ基因相对拷贝数(nosZ/16S rDNA)，以及nosZ基因与nirK和nirS基因之和(nir)的比值(nosZ/nir)均高于其他3个季节。春季除S1、S2站位外底泥全氮含量均低于其他季节，而浸出液NH4+-N浓度均值在4个季节中最低。较高的nosZ/nir比值说明在春季营养盐水平相对较低的沉积物环境中，可能发生了完全反硝化过程[21]。相比于nirK基因，nirS基因丰度在4个季节均较高，其中，夏季各站位nirS基因丰度显著高于春、秋季(P<0.05)，仅在春季nirK/nirS基因丰度比值出现升高，说明nirS型反硝化菌在射阳湖保护区底泥反硝化过程中扮演重要角色。研究表明，与nirS型反硝化菌相比，含nirK基因的菌群适合在溶解氧浓度稍高、有机物浓度较低的环境生长[22]。在富营养化较为严重的太湖沉积物中nirS型反硝化菌是主要的生态类型[23]，与之类似，射阳湖水域沉积物中的厌氧环境更适宜nirS型反硝化菌生长。

与上述反硝化功能基因相比，调查发现射阳湖水域沉积物中硝化功能基因(如nxrA和AOB-amoA)丰度相对较低。冬季nxrA和AOB-amoA基因丰度均值高于其他季节，其中，nxrA基因丰度显著高于其他季节(P<0.05)，可能与上覆水较高的NH4+-N浓度有关。研究表明，NH4+-N浓度较低的环境适宜AOA的生长，而在富营养化水域，AOB是驱动硝化作用的主要微生物类群[24]。笔者研究未调查AOA-amoA基因丰度，但在上覆水或底泥中NH4+-N浓度较低的季节，AOA可能也在硝化过程中发挥作用。

2.4 氮循环功能基因与主要环境因子的相关分析

通过将氮循环功能基因与主要环境因子进行相关分析(图5)，发现AOB-amoA基因丰度分别与nxrA和nirS基因丰度呈极显著正相关，且nxrA基因丰度与nirS基因丰度呈显著正相关。由3种功能基因编码的AMO、NXR和NIR分别调控氨氧化、硝化和反硝化作用，依次将NH4+-N转化为NO2--N，将NO2--N转化为NO3--N，以及将NO2--N转化为NO或NH3[20,25]。上述结果表明，传统的硝化、反硝化路径可能在射阳湖水域沉积物氮循环中占据重要地位。此外，narG基因丰度分别与nirK基因和nosZ基因丰度呈显著正相关，且nirK基因丰度与nosZ基因丰度呈极显著正相关，3种反硝化功能基因丰度均在春季出现明显升高。李秋芬等[26]研究发现环境中同时存在含nirK和nosZ基因的反硝化菌，春季此类反硝化菌可能在射阳湖水域大量出现。

底泥浸出液中NH4+-N含量与nosZ基因丰度及上覆水pH值呈显著负相关，与nosZ/nir和nirK/nirS呈极显著负相关。春季多数站位较低的底泥全氮含量以及底泥浸出液NH4+-N浓度可能与nosZ与nirK基因丰度升高有关。此外，上覆水pH值与nirK和nosZ基因丰度，以及nosZ/nir和nirK/nirS比值呈极显著正相关；同时，pH与Chl a浓度呈极显著正相关。春季藻类大量繁殖引起上覆水pH升高，进而对底泥微生物群落氮循环菌具有一定影响。

底泥中全碳与全氮含量呈极显著正相关，与上覆水CODMn浓度呈显著正相关，表明上覆水中污染物的沉降是底泥有机污染的主要源头，并引起内源性营养物质负荷增加[27]。上覆水NH4+-N浓度与水温和Chl a浓度呈显著负相关，而上覆水NOx--N浓度与水温呈极显著正相关。藻类一般优先利用污水中 NH4+-N 和其他还原态氮，它们对硝酸盐的吸收利用仅仅发生在污水中 NH4+-N 浓度很低或耗尽的情况[28]。春、夏季水温升高导致射阳湖水域Chl a浓度升高，藻类对不同形态氮素的选择性吸收利用是引起上覆水中NH4+-N浓度降低的原因之一。

3 结论

射阳湖国家级水产种质资源保护区存在水体轻度富营养化问题，TN和TP是决定该水域所属环境质量类别的关键指标。不同季节保护区水体氮、磷浓度的空间分布存在一定差异，射阳湖镇污水排放和农业污染输入可能是造成氮、磷浓度时空差异的主要原因。

射阳湖保护区4个季节底泥中全碳、全氮和全硫含量在S1(靠近村镇)和S3(靠近农业区)站位较高。其中，S1站位春、夏季底泥全硫含量明显升高，且底泥全碳和全氮含量也处于较高水平。

氮循环细菌功能基因拷贝数及其占细菌16S rDNA比例对底泥氮污染状况具有一定指示作用。在射阳湖保护区底泥反硝化过程中nirS型反硝化菌占主导地位，另外，同时含nirK和nosZ基因的反硝化菌丰度可能在春季较高。