多指标-响应面法优选山茱萸酒制工艺*

黄 莉，杨 磊，李玉星，肖望重，于 慧，戴 冰

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南交通工程学院，湖南 衡阳 421001）

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，具补益肝肾、涩精固脱功效[1]。纵观历代文献，山茱萸的炮制方法主要有阴干、打碎、去核、炒、酒制（酒炒、酒蒸、酒炖、酒浸）、盐炒、熬、雄羊油炙等，其中酒萸肉在临床较为常用，酒制后其滋阴补肾作用增强[2]。其中所含苷类成分（莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷等）是其增强机体免疫，补益肝肾的主要药效成分[3]。

传统的酒萸肉炮制方法为取山萸肉用20%黄酒拌匀，置于适宜容器内，密闭，隔水加热，炖至酒被吸尽，色变黑润，取出干燥即可，一般情况下山萸肉的闷润时间为2 h，蒸制时间为4 h[4]。2020年版《中华人民共和国药典》收载的炮制品有山萸肉和酒萸肉，且规定酒萸肉的炮制为每100 kg待炮制品，用黄酒10～20 kg。然而，目前已开展的酒萸肉炮制工艺研究多集中在黄酒用量、闷润时间及蒸制时间等，鲜有考察黄酒酒精度对其工艺、质量及功效的影响[5-9]。

本研究考察了辅料黄酒的酒精度、黄酒用量、闷润时间及蒸制时间对山茱萸中莫诺苷、马钱苷及獐芽菜苷多个指标成分含量的影响，结合星点设计-响应面法优选山茱萸酒制工艺，以期为酒萸肉的质量控制提供参考依据。

1 材料与试剂

1.1 仪器 Agilent 1260 infinity Ⅱ型高效液相色谱仪（含G7111A四元泵、G7117C DAD检测器、G7129A自动进样器，美国安捷伦公司）；SK5200H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；AUX220型电子分析天平（日本SHIMADZU公司）；AUX220D电子分析天平（日本SHIMADZU公司）；0.45 μm微孔滤膜（日本SHIMADZU公司）；HCP-400A型高速多功能粉碎机（浙江省永康市金穗机械制造厂）。

1.2 试药 山茱萸（湖南春可回中药饮片有限公司，批号：191201）经湖南中医药大学张裕民教授鉴定为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。莫诺苷标准对照品（成都普思生物科技股份有限公司，批号：PS0500-0025MG）；马钱苷标准对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111640-201005）；獐牙菜苷标准对照品（中国药品生物制品检验所，批号：111742-200501）；乙腈为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司，批号：20170104）；磷酸（天津市大茂化学试剂厂）；其他试剂均为分析纯。龙泉花雕酒，购自大连长兴岛酒业有限公司，采用密度瓶法测定其酒精度。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备[10]取酒萸肉粉末（过四号筛）1 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加80%甲醇溶液定容至刻度，称质量，超声提取（功率：200 W，频率：53 kHz）45 min，取出，冷却后再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称定莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷对照品适量，置50 mL棕色容量瓶中，加80%甲醇溶解并定容成质量浓度分别为1.45、1.40、1.05 mg/mL的对照品母液，置于4 ℃冰箱，备用。分别精密吸取上述母液0.4 mL，置于同一10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，即得混合对照品溶液，质量浓度分别为58、56、42 μg/mL。

2.2 色谱条件及系统适用性试验 色谱柱为Hypersil C18柱（4.6mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.3%磷酸水（B），梯度洗脱（0～10 min，15%A；10～25 min，15%A～20%A）；流速为1.0mL/min，柱温为35 ℃；检测波长为240 nm，进样量为10 μL。在上述色谱条件下，精密吸取溶剂空白溶液、混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入色谱仪进行分析，记录图谱。结果表明，溶剂空白溶液色谱图无干扰；混合对照品溶液色谱图中，莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷的相对保留时间分别为5.45、9.84、11.55 min；在供试品溶液色谱图中，各峰分离度均大于1.5，且理论塔板数均大于10 000，故该色谱条件的系统适用性良好。（见图1）

图1 各样品溶液HPLC 图

2.3 山茱萸的酒制炮制方法 取生山茱萸，净制，除去果核、果梗、霉变品、虫蛀品等残次品，取净山萸肉200 g，照酒蒸（《中华人民共和国药典》2020年版四部通则0213）蒸至酒吸尽，即得。

3 方法学考察

3.1 线性关系考察 精密吸取莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷对照品母液各0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分别置于同一5 mL容量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，得到不同浓度梯度的混合对照品溶液。按“2.2”项下色谱条件进样测定。以峰面积（Y）为纵坐标，进样浓度（X，μg/mL）为横坐标进行线性回归。莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷的线性方程分别为：Y=5 310X-27.835（r=0.999 6）、Y=4 079.7X+1.793 3（r=0.999 7）、Y=991.4X+24.46（r=0.999 2）。结果表明莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷分别在29～174、28～168、21～126 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

3.2 精密度试验 精密量取莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件，连续进样6次，进样量为10 μL，测定6次峰面积值，RSD分别为0.37%、1.96%、1.54%，结果表明仪器精密度良好。

3.3 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液10 μL，于室温下放置0、3、6、9、12、18、24 h后，按“2.2”项下色谱条件分别进样，测定莫诺苷、马钱苷、獐芽菜苷的峰面积值。RSD分别为1.50%、0.35%、1.75%，结果表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定。

3.4 重复性试验 精密称取同一酒萸肉样品，按“2.1.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，测定峰面积值，并计算其含量。莫诺苷平均质量分数为1.52%，RSD为1.49%；马钱苷平均质量分数为0.98%，RSD为0.3%；獐牙菜苷平均质量分数为0.155%，RSD为1.88%。结果表明此方法重复性良好。

3.5 加样回收率试验 取已知莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷含量的酒萸肉粉末0.5 g，精密称定，平行称取6份，每份按1∶1的比例分别加入适量对照品溶液，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定。记录峰面积，并计算平均回收率与RSD。莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷的平均回收率分别为98.92%、99.12%、100.23%，RSD分别为1.58%、1.87%、1.69%（n=6），结果表明该方法准确度高。（见表1）

表1 加样回收率试验结果（n=6）

4 星点设计-响应面法优选山茱萸酒制工艺

4.1 总评归一值计算[11]以莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷为指标，采用Hassan法进行归一化处理，莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷取值越大越好，单指标评价值（d）按式（1）进行计算，总评归一值按式（2）换算。

其中：d为单指标评价值，d1为莫诺苷指标评价值，d2为马钱苷指标评价值，d3为獐牙菜苷指标评价值，Yi为指标中第i个值，Ymin为指标中最小值，Ymax为指标中最大值。

4.2 星点设计-响应面试验设计与结果 以黄酒酒精度、黄酒用量、闷润时间和蒸制时间为考察因素，以莫诺苷、马钱苷及獐牙菜苷含量总评归一值为综合评价指标，进行4因素5水平的试验设计。因素与水平见表2，星点试验设计与结果见表3。

表2 因素与水平

表3 星点试验设计与结果

4.3 模型拟合与方差分析 根据试验结果，采用使用Design-Expert 11软件，以总评OD值为因变量对各因素进行多元二项式拟合，得二次多项回归拟合方程为OD=0.651 667+0.069333A-0.07217B+0.054833C-0.02817D+0.02775AB+0.06AC+0.03325AD+0.024 875BC+0.018 625BD+0.027 375CD-0.042 25A2-0.040 13B2-0.116 63C2-0.078 13D2（R2=0.824 5，P＜0.002）。方差分析结果见表4。

表4 二次多项式回归方程模型方差分析

表4结果显示，模型P=0.001 8＜0.01，说明所采用的回归模型具有统计学意义，失拟项P=0.072 7＞0.05，表明失拟项不显著，故该方程拟合的模型可用于预测山茱萸酒制最佳工艺。其中黄酒用量（B）、C2、D2项P＜0.01，差异有统计学意义；黄酒酒精度（A）、闷润时间（C）项P＜0.05，差异有统计学意义；AB、AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2项均不显著，说明单因素对OD值的影响远远超过交互项，且因素影响顺序为B＞A＞C＞D。

4.4 响应面法优化山茱萸酒制工艺 根据响应曲面分析绘出各因变量的曲面，结果显示最佳工艺条件为A=14%、B=24 kg，C=159 min、D=214.9 min，OD=0.714。综合实际操作考虑，确定最佳炮制工艺为黄酒酒精度为14%，黄酒用量为药材的24%，闷润时间为160 min，蒸制时间为215 min。（见图2）

图2 A、B、C、D 因素对OD 值影响的响应面3D 图

4.5 验证试验 根据优选出的最佳炮制工艺条件按“2.3”项下平行炮制3份酒萸肉，按“2.2.1”项下方法制备样品溶液，以“2.1”项下色谱条件检测莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷含量，计算其OD值，实验结果显示该模型具备较高的准确性和精密性，可较好地预测酒制山茱萸的炮制工艺，其所优选工艺有效、可行，且稳定性较好，其验证结果见表5。

表5 工艺验证试验结果

5 讨 论

中药炮制工艺多采用单因素考察[12]、正交试验设计法[5,8]、均匀设计法[13]、星点设计-响应面法[10-11]等模型进行优化，其中单因素考察法难以全面观察整体优化效果，正交设计存在试验精密度不够、各因素间交互作用无法考察、试验次数多等问题。而星点设计-响应面法能同时进行线性、二项多项式或更高次项的模拟拟合，具有全面考察多因素交互作用、试验次数少、预测性高等优点[14-15]。故笔者采用星点设计-响应面法优化出的山茱萸酒制工艺稳定可控。

辅料黄酒是用糯米、酒药、红曲和水为原料，经酿造而成的发酵酒，为淡黄色澄明液体，味醇气香，其中乙醇体积分数（简称酒精度数）一般要求8%以上[16]。乙醇作为两亲性溶剂，能在药材闷润一定时间后产生助溶或吸附作用，且浓度不同时会使多糖、皂苷、黄酮类化学成分的浸出效应差异化，进而影响酒制后药材的临床疗效。研究发现，生产黄酒各厂家的酿酒工艺不同，可影响辅料黄酒的含糖量、酒精度、pH值、总酸、β-苯乙醇等[17-18]。山茱萸产自浙江、陕西、河南等地，气候、土壤、生长环境等因素不同均可改变其药效成分含量，产生不同的补肾增效作用[19-20]。笔者选择同一厂家生产的不同酒精度的黄酒作为辅料，结果发现辅料黄酒的酒精度、用量均对酒萸肉苷类成分有较大影响。故建议《中华人民共和国药典》规范山茱萸酒制工艺中辅料黄酒的酒精度、黄酒用量及闷润时长，以保障酒萸肉的生产及临床应用质量。