小型浅水湖泊氨氧化细菌分布特征及其对氮素垂向分布的响应

燕文明，温茂增，麻 林，聂小保，陈 翔，吴挺峰

(1.河海大学水文水资源与水利工程科学国家重点实验室，江苏 南京 210098；2.湖南省水利厅，湖南 长沙 410007；3.长沙理工大学水利工程学院，湖南 长沙 410007；4.中国科学院南京地理与湖泊研究所，江苏 南京 210008)

氨氧化细菌(Ammonia-OxidizingBacteria，AOB)是氨氧化反应的主要承担者之一，广泛分布于土壤、湖泊及海洋等环境中[1]。研究发现的AOB大多属于β-Proteobacteria亚纲和γ-Proteobacteria亚纲，β-Proteobacteria分为亚硝化螺菌群(Nitrosospira)和亚硝化单胞菌群(Nitrosomonas)，多存在于非海洋生境中，而γ-Proteobacteria亚纲多见于陆地、海洋生境中[2]。目前，学者们已经开展了大量以AOB为主题的研究工作，Horz等[3]发现AOB会因温度、降水量等环境因子的改变产生明显的响应；Ruben等[4]发现城镇河流岸边与水体中AOB的群落组成相似；Garnier等[5]对塞纳河水体中的AOB优势种群进行分析，并研究了AOB丰度对环境变化产生的响应。可见，围绕某区域中AOB影响因素和群落特征的研究已较为深入，而不同来源污染物对AOB群落分布特征影响方面的研究相对较少。AOB在地球氮素循环中扮演着重要的角色[6]。本文选取淮河流域里下河地区浅水湖泊作为研究对象，识别不同污染类型的表层底泥中AOB群落的特征，解析AOB丰度和分布对硝酸盐外源输入的响应，研究成果可为沉积物氮素分布特征和迁移转化研究提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 研究区概况和沉积物采集

淮河流域里下河地区湖荡众多，近年来受人类活动的影响，水体污染状况加剧，自净功能减弱[7]。样品采集时间为初秋季节，采样点分别为得胜湖中心(DS)、九龙口东北入湖口(JLK)、大纵湖北部(DZ1)以及大纵湖中心(DZ2)(图1)，平均水深分别为3.5 m、1.5 m、2.1 m和1 m，各采样点受人类活动影响的程度差别较大，污染物来源各不相同。得胜湖周边有化肥厂与采砂场，湖区有围网养殖；九龙口刚疏浚，上游存在渔畜禽类养殖区；大纵湖北部围网养殖密集，湖心水生植物繁密。使用抓斗式采样器采集表层10 cm左右的沉积物，速冻后运回实验室用于DNA提取和理化性质测定。

图1 研究区采样点布设与位置Fig.1 Arrangement and location of sampling points in the study area

1.2 上覆水理化性质测定

1.3 沉积物相关指标测定

1.4 DNA提取、PCR扩增与系统发育分析

将冻干过筛后的0.5g沉积物进行DNA提取和纯化，经70%乙醇与TE溶液处理后体积为50 μL，-20℃保存。重复3次，合并稀释后作为模板进行25 μL体系扩增。采用特异性引物amoA-1F (5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′) 和amoA-2R (5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)[11]进行amoA基因扩增。参照文献[12]克隆与测序，最后获得AOB核酸序列登录号为KM516473- KM516706。使用DOTUR软件选取代表性序列，在GenBank中比对最相似序列，再选取参照序列，用ClustalX 1.8、Jukes-Cantor模型、MEGA 5.0进行序列比对、计算距离和检验对比，通过Kimura 2 参数矩阵的邻接法构建系统发育树[13]，并评估进化树的可靠性，自举值为1 000次。

1.5 多样性分析方法

通过 DOTUR软件计算克隆文库覆盖率(C)、Shannon-Wiener多样性指数、Simpson多样性指数、Sace丰度指数以及Chao1丰度指数。Shannon-Wiener和Simpson多样性指数反映群落结构的复杂程度，Sace丰度指数和Chao1丰度指数表示种类丰富程度。

C=[1-(n1/N)]×100%

(1)

式中：n1——分类操作单元(operational taxonomic unit,OTU)数目；N——相应克隆库的总克隆数量[14]。

1.6 反硝化同位素测定方法

菌种为致金色假单胞菌(P.aureofaciens)，编号NRRLB-1578。将复活复壮的菌株接种到胰蛋白大豆肉汤培养基，浓缩后倒入顶空瓶，用高纯N2吹出N2O，加入蒸馏水，搅拌、震荡、离心，用气密性注射器将离心后的上清液注入带有浓缩菌的顶空瓶中，倒置放入恒温箱30℃过夜培养。第2天注入NaOH溶解培养产生CO2。用带有预浓缩装置和气相色谱仪的稳定同位素质谱仪(MAT-253，Thermo，美国)分析N2O中的δ15N[15]。

2 结果与讨论

2.1 基本理化性质

表1 各采样点基本理化指标

2.2 沉积物-水界面的氮素分布特征

2.2.1 间隙水中TN和可交换态氮的垂向分布特征

图2 间隙水TN和可交换态氮的垂向分布特征Fig.2 Vertical distribution characteristics of TN and exchangeable nitrogen in interstitial water

2.2.2 沉积物中TN和可交换态氮的垂向分布特征

图3 沉积物中TN和可交换态氮的垂向分布Fig.3 Vertical distribution of TN and exchangeable nitrogen in sediments

2.3 amoA基因多样性分析

利用细菌特异性PCR引物来扩增AOB的amoA基因，获得491 bp的扩增产物。在挑出的240个克隆序列中，成功测定了235个，DS、JLK、DZ1、DZ2的目的序列克隆数分别为59个、58个、59个、60个。将测序结果用ClustalX1.8和Dnadist软件生成相似矩阵，用DOTUR软件进行OTU划分。根据式(1)计算的克隆文库的覆盖率大于75%(表 2)，包括了大多数的amoA基因的类型。通过表 2可知，DS的Shannon-Wiener和Simpson多样性指数大于其他采样点；DZ1的AOB生物多样性最低；DZ2与DZ1相比，多样性指数与丰度指数均较高。

表2 AOB的amoA多样性

2.4 amoA基因系统发育分析

按95%同源性将沉积物中AOB的amoA基因克隆序列分为20个OTU，用Blast寻找参比序列，用MEGA5.0构建系统发育树(图4)，分为4个Cluster，共235个序列。Cluster 1、Cluster 2和Cluster 3聚类于亚硝化单胞菌属，Cluster 4聚类于亚硝化螺菌属。Cluster1中包含了68个序列，占28.9%，被分为7个OUT，分别从DS、JLK、DZ1、DZ2中分离得到21个、14个、2个和31个；参考序列来自长江口、废弃的矿业池塘、沙质河流沉积物和废水处理系统中。Cluster 2中包含147个序列，占62.6%，被分为5个OUT，分别从DS、JLK、DZ1、DZ2中分离得到32个、39个、50个和26个；参考序列来自湖泊沉积物、河口沉积物、废水处理系统。Cluster3中包含2个序列，仅占0.9%，被分为2个OUT；参考序列来源于废水处理系统。Cluster 4中包含18个序列，占7.7%，被分为6个OUT，分别从DS、JLK、DZ1、DZ2中分离得到4个、6个、6个和2个。Cluster 4同时又可分为两个亚Cluster，第一个亚Cluster有6个序列，来自DS、DZ2、JLK，分别有3个、1个和2个，参考序列来源于城市饮用水配送系统和长江口；另一个亚Cluster有12个序列，来自DS、DZ1、DZ2、JLK，分别有1个、6个、1个和4个，参考序列为城市饮用水配送系统和富营养化淡水沉积物。DS和DZ2中的AOB主要聚类于Cluster1和Cluster2；JLK和DZ1的AOB主要聚类于Cluster2。20个OUT代表序列与参考序列的基因片段在核苷酸水平上的同源性均为95%。在20个OTU中，聚类于Cluster1和Cluster2中的OTU1和OTU12能在所有样品中找到，序列数量最多，分别为53个(22.6%)和122个(51.9%)。4个采样点表层沉积物AOB都属于β-Proteobacteria亚纲的亚硝化单胞菌群(占92.3%)和亚硝化螺菌群。亚硝化单胞菌属共有217个克隆序列，占14个OTU；亚硝化螺菌属只有18个序列，占6个OTU。

图4 AOB的amoA基因序列的系统发育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of amoA gene sequence of ammonia-oxidizing bacteria

2.5 AOB的分布与同位素溯源分析

Purkhold等[18]的研究指出，亚硝化螺菌属易在低氨环境中有更优的氨氧化功能，而亚硝化单胞菌属通常在富含氨氮环境中有竞争优势；在235个amoA基因克隆序列中有217个序列属于亚硝化单胞菌群，占92.3%，反映了氨氮污染程度较高的现状。DZ2中AOB的Nitrosospira群落占该点总克隆序列的3.34%，δ15N为1.0%，结合该点沉水植物密集的状况，认为硝酸盐主要来源于植物的腐烂。DS、DZ1、JLK的Nitrosospira群落占各采样点总克隆序列的比例是DZ2的2倍以上，分别为6.8%、10.4%和10.4%，氮同位素比值偏正(0.829%、0.569%和0.884%)。结合现场状况，既有养殖污染汇入，又有农业面源污染，导致了Nitrosospira群落较丰富，与已有研究存在共性[19-21]，即农牧废水湿地处理系统中AOB以Nitrosospira为主，而畜类粪便和冲洗水中以Nitrosomonas为主。DS中的AOB生物多样性和丰度最高，可能与得胜湖AOB的来源较为复杂有关，硝酸盐定源结果为混合型污染(氮同位素比值为0.829%)。

周边环境的复杂性影响AOB的生物多样性和相对丰度。DZ1的AOB生物多样性和氮同位素比值低于DS、DZ2和JLK，可能与该采样点受围网养殖的直接影响较大有关，长期围网养殖增加了人为污染源的注入量，降低了氮同位素比值，并造成该采样点生物多样性和相对丰度的降低。可见，同一区域拥有不同污染物来源的湖泊表层底泥中硝氮δ15N存在差异，长期的围网养殖(DZ1)会导致δ15N降低(0.57%)、AOB的丰度和生物多样性降低；腐烂植物(DZ2)的长期过度累积会导致δ15N增大(1.0%)，AOB的丰度和生物多样性降低。

3 结 论

得胜湖、九龙口和大纵湖存在AOB，丰度最多的是亚硝化单胞菌属(占92.3%)。DS、DZ1和JLK表层沉积物中亚硝化螺菌属相对丰度是DZ2的2倍以上。环境与污染来源复杂的地方AOB的生物多样性较高，得胜湖AOB生物多样性和丰度最高，大纵湖入湖口的AOB生物多样性最低。长期的围网养殖增加了人为污染源的注入量，降低了氮同位素比值，降低了AOB的丰度和生物多样性。