甲基睾酮暴露对鳗鲡精巢发育的影响

赖晓健，彭 帅，张 哲，李忠琴

( 1.集美大学 水产学院，福建 厦门 361021； 2.鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门 361021； 3.福建省水产研究所，福建 厦门 361000 )

鳗鲡(Anguillajaponica)为生殖洄游性鱼类,在降海洄游过程中性腺逐步发育成熟，并在大海中完成排卵、受精和胚胎发育。实验室条件下，人工养殖或下海的亲鳗需要人工诱导性腺才能发育成熟。应用外源激素对鳗鲡性腺进行人工诱导，结果表明，雌鱼的性腺较雄鱼更难诱导成熟，所需的外源激素剂量和诱导时间更长[1]。因此，现有的研究针对雌性鳗鲡较多，而涉及雄性鳗鲡的较少[1]。然而在鳗鲡的人工繁育中，雌、雄鳗鲡性腺发育的同步性也是重要的影响因素。

目前，人工诱导鳗鲡性腺发育成熟的主要方法是注射鲤鱼(Cyprinuscarpio)或鲑鱼垂体匀浆液和人绒毛膜促性腺激素(HCG)混合液[2]。也有学者应用埋植或注射雄激素的方法诱导鳗鲡性腺发育和成熟[1-3]。其中埋植甲基睾酮(MT)6次后(90 d)，雄鱼性成熟比达88.89%；但是埋植需要每15 d操作1次[3]。为减少对亲鱼的机械损伤，笔者通过改变给药方式，在养殖水体中加入甲基睾酮，探索其对鳗鲡雄鱼性腺发育的影响，并为改进鳗鲡雄鱼的人工催熟技术提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

由于鳗鲡的年龄、生长环境和激素处理的方法和时长不同，导致性腺发育的程度各不相同。西太平洋沿岸不同地区鳗鲡亲鱼的平均下海年龄为(5.2±0.8)～(8.3±1.6)龄[4]，所以试验采用本实验室饲养的7龄鳗鲡雄鱼。

鳗鲡亲鱼取自集美大学水产学院海水试验场，全长(61.00±1.00) cm，体质量(266.45±18.65) g。

1.2 试验设计

60尾亲鱼随机分为对照组和试验组，采用直径1.5 m、高1.0 m的圆形养殖桶为试验容器，水量1000 L，水体为盐度35的海水。甲基睾酮标准品购自大连美仑生物技术有限公司(MB1943-S)，称取50 mg甲基睾酮先溶解于5 mL无水乙醇，再加入养殖水体中，使试验组甲基睾酮最终质量浓度为50 μg/L，对照组加入5 mL无水乙醇。对照组和试验组各设2个平行组，每桶10尾亲鱼。试验时间为45 d，其间不投喂，对照组和试验组每5 d换水1/2，同时补充相应的甲基睾酮或无水乙醇，试验期间控制水温(21±1) ℃。试验结束，对照组和试验组各随机采样5尾。

1.3 生物学数据和组织切片

麻醉试验鱼，测量体质量和全长。用注射器尾静脉取血。解剖取性腺及肝脏，称量质量，并计算性腺指数(wGSI，%)和肝体比(wHSI，%)：

wGSI=m1/m×100%

wHSI=m2/m×100%

式中，m为体质量，m1为性腺质量，m2为肝脏质量。

取部分性腺组织用新配置的4%多聚甲醛固定8～12 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。连续切片5 μm，苏木精—伊红染色，Leica DM5500B显微镜观察和拍照。

1.4 ELISA法测定血清中雌二醇和11-酮基睾酮的质量浓度

取全血标本室温放置2 h或4 ℃过夜后于3068 r/min(离心半径9.5 cm)离心15 min，取上清液置于-20 ℃保存备用。根据Estradiol ELISA试剂盒和11-Keto Testosterone EIA试剂盒(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan, USA)说明书的操作方法检测血清中雌二醇和11-酮基睾酮的质量浓度。对照组和试验组间的差异用t检验进行分析。

2 结 果

2.1 鳗鲡精巢的发育情况

试验结束后，轻压试验组鱼腹部，尚不能挤出精液。测得试验组性腺指数为(1.63±0.68)%，显著高于对照组(P<0.05)，约为对照组的8倍。试验组肝体比为(1.49±0.10)%，极显著高于对照组(P<0.01)(表1)。

表1 甲基睾酮暴露对鳗鲡精巢发育的影响 %

剪开鱼腹部，可见对照组精巢处于Ⅱ期，整体为红色细带状，布满血管，边缘为锯齿状(图1a)。试验组精巢处于Ⅳ期，为乳白色的片状(图1b)。组织切片可观察到对照组精小囊处于精子发生的精原细胞增殖期(S1期)，生殖细胞多为精原细胞，细胞呈圆形，核噬碱性；精巢出现少量精母细胞，其细胞核染色更深(图2a)。试验组精巢的精小囊发育变大，处于精子发生的精子形成期(S5期)。精母细胞分布在精小囊壁上，精小囊中充满精细胞，并已出现游离的精子(图2b)。

图1 鳗鲡精巢组织Fig.1 Testis of Japanese eel A. japonicaa.对照组精巢； b.试验组精巢； 箭头所示为精巢.a.testis in the control group; b.testis in Japanese eel exposed to MT group; arrows show the testis.

图2 鳗鲡精巢组织切片Fig.2 Photomicrographs of histological sections of testis in Japanese eel A. japonicaa.对照组精巢组织； b.试验组精巢组织； SPG.精原细胞； SPC.精母细胞； SPD.精子细胞； SPZ.精子.a.testis in the control group; b.testis in Japanese eel exposed to MT group; SPG.spermatogonia; SPC.spermatocyte; SPD.spermatid; SPZ.spermatozoon.

2.2 血清中雌二醇和11-酮基睾酮的质量浓度

试验组鳗鲡血清中雌二醇质量浓度为(182.06±30.52) pg/mL，显著高于对照组的质量浓度(3.69±0.72) pg/mL (P<0.05)；11-酮基睾酮质量浓度为(7.30±2.15) pg/mL，与对照组的质量浓度(5.67±0.37) pg/mL相比无显著差异(图3)。

图3 鳗鲡血清11-酮基睾酮和雌二醇质量浓度Fig.3 Serum 11-KT and E2 levels in Japanese eel A. japonica相同上标字母表示无显著性差异(P>0.05)，不同上标字母表示有显著性差异(P<0.05).Means with the same letter are not significant differences (P>0.05), and means with different letters are significant differences (P<0.05).

3 讨 论

鳗鲡的人工繁育技术是世界性的难题，我国自20世纪70年代开始开展鳗鲡的人工繁殖技术研究，通过外源激素诱导得到性腺发育成熟的亲鳗，并得到受精卵和初孵仔鱼，但目前仔鱼很难度过开口期，存活时间大多仅7～20 d。日本自20世纪60年代开始相关研究，2010年在实验室获得子二代的初孵仔鱼[5]。但是由于鳗苗产量低和高昂的柳叶鳗培育成本，目前还不能大批量培育白仔鳗苗，无法达到鳗鲡商业化养殖的要求，因此相关的技术需要进一步研究，如亲鱼人工催熟催产技术的优化，卵子质量的提高，柳叶鳗的培育技术及其理化条件的优化，柳叶鳗期的缩短等[6]。相对雌鳗，雄鳗的人工催熟和催产技术较为简易，但仍需重复多次注射操作，因此容易造成机械伤害从而降低精子的质量。

3.1 甲基睾酮暴露促进鳗鲡精巢发育

本试验结果显示，甲基睾酮暴露45 d促进了鳗鲡雄鱼的精巢发育，精巢从Ⅱ期发育至Ⅳ期，此时精巢以精细胞为主，与长鳍裸颊鲷(Lethrinuserythropterus)和长臀(Cranoglanisbouderius)的Ⅳ期精巢相似[7-8]。精小囊从精原细胞增殖期发育至精子形成期，已出现游离的精子。方琼珊等[9]研究发现，鳗鲡雄鱼按鲤鱼垂体0.2 mg/尾+人绒毛膜促性腺激素25 IU/尾诱导35 d后，精小叶中有大量初级精母细胞和次级精母细胞、少数精子细胞以及管腔中存在少量精子；张洁明等[10]采用鲤鱼脑垂体0.5 mg/kg+人绒毛膜促性腺激素50 IU/kg注射催熟鳗鲡雄鱼，在注射7针后，63.2%的雄鱼可发育至精子出现期。上述研究中雄鱼的精巢发育期与本试验中试验组雄鱼近似。鳗鲡雄鱼腹腔埋植甲基睾酮(50 μg/g)3次(45 d)后，雄鱼成熟率达到41.67%[3]。鱼体内埋植的甲基睾酮作用更为迅速和直接，因而诱导效果优于本试验，但本试验的操作简便，也易于生产应用。欧洲鳗鲡(A.anguilla)雄鱼的相关研究显示，经腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(1.5 IU/g)4周后，性腺指数即出现显著升高，约为4%，高于本试验结果，但此时精巢发育大多处于Ⅳ期[11]。人绒毛膜促性腺激素的生理作用与促黄体生成素(LH)近似，与促黄体生成素在性腺细胞中共享一个共同的受体LHR，人绒毛膜促性腺激素通过与精巢中Sertoli细胞和Leydig细胞膜上的LHR受体特异性的结合[9]，刺激精巢合成和分泌睾酮从而间接起到促进精子发生的作用[12]，而甲基睾酮可直接作用于性腺，促进精子发生[13]，效果更为直接。

3.2 甲基睾酮暴露对鳗鲡血清11-酮基睾酮和雌二醇水平的影响

鱼类精子的发生过程需要内分泌激素的调控才能完成，体外试验证明雄激素的氧化物11-酮基睾酮在鳗鲡精子发生的整个过程均起到推动作用[14]。但本试验结果显示，经甲基睾酮暴露45 d后，雄鱼血清11-酮基睾酮质量浓度较对照组未显著升高。已有的研究表明，11-酮基睾酮在精原细胞的增殖过程起主要作用[12,14-17]，但对减数分裂过程作用不明显。本试验中，试验组精子发生处于精子形成期，属于精子发生的晚期，此时11-酮基睾酮的含量与对照组相比无显著升高，推测此时11-酮基睾酮的作用不明显，甲基睾酮转化为11-酮基睾酮的效率很低。同样，在欧洲鳗鲡雄鱼中，虽然人绒毛膜促性腺激素注射3周后，血清11-酮基睾酮含量达到峰值，但是随后逐渐下降，在人绒毛膜促性腺激素注射7周后(精巢处于Ⅴ～Ⅵ期)，与注射前含量相比无显著差异[11]。其他鱼类的研究也显示，雄鱼开始排精后，血清11-酮基睾酮含量下降，如北极红点鲑(Salvelinusalpinus)[18]和远东哲罗鲑(Huchoperryi)[19]。

试验组雌二醇质量浓度显著高于对照组，推测是部分甲基睾酮通过芳香化酶的作用转化成雌二醇。相似的研究发现，赤点石斑鱼(Epinephelusakaara)埋植甲基睾酮8周后，性腺芳香化酶活性和血清雌二醇质量浓度同步升高[20]。以往的研究显示，雌二醇虽然是一种雌激素，但是在雄鱼精子发生过程中也是不可或缺的。体内和体外试验均表明，10 pg/mL以上质量浓度的雌二醇就能够促进鳗鲡精原干细胞的更新[2]。在青鳉(Oryziaslatipes)[21]的研究中发现，低浓度(0.01 nmol/L和1 nmol/L)的17α-乙炔雌二醇能刺激体外培养的精巢中精原干细胞的增殖，高浓度的雌二醇(100 nmol/L)反而起抑制作用。本试验中，试验组的血清雌二醇质量浓度为(182.06±30.52) pg/mL[(0.67±0.11) nmol/L]，此质量浓度的雌二醇可促进精子发生。雌二醇的作用机理是通过升高视黄醇结合蛋白Ⅰ、Ⅱ基因的表达以调控视黄酸的合成，从而调控未分化的精原细胞增殖和分化[22]。

甲基睾酮埋植的鳗鲡雄鱼脑部和垂体促性腺激素释放激素GnRH含量也显著高于对照组[3]。推测甲基睾酮暴露也可能对下丘脑—垂体轴产生正反馈调节作用，促进下丘脑促性腺激素释放激素的合成和分泌，进而促进精巢的发育和成熟。在欧洲鳗鲡中，经人绒毛膜促性腺激素注射3周后，雄鱼中脑和间脑的mGnRH表达量达到峰值，Pearanda等[11,23]推测11-酮基睾酮同样通过正反馈调节作用提高GnRH的表达量。

4 结 论

本试验采用甲基睾酮浸泡的方法，在已有研究的基础上改变外源激素的种类和给药方式，减少人工操作带来的机械损伤，通过较长时间的微量甲基睾酮的暴露，试验组鱼精巢发育至Ⅳ期，精子发生至精子形成期，已出现游离的精子，说明甲基睾酮能够极大地促进精巢的发育。如果后期通过注射人绒毛膜促性腺激素和鲤鱼垂体再进行催熟，所需的剂量和针数相比对照组雄鱼可大幅减少。下一步的研究可通过优化组合不同的激素及其剂量，以进一步促进精巢发育，提高成熟度。