应用网络药理学的方法探讨速效平喘合剂治疗支气管哮喘合并气道重塑的作用机制

胡金涛，曹俊岭，欧阳竞锋，王添全，胡志伟，林美娇

(1.北京中医药大学东直门医院药学部，北京 100700； 2.北京中医药大学东方医院药学部，北京 100078； 3.中国中医科学院医学实验中心形态学实验室，北京 100010； 4.北京中医药大学中药学院临床药理系，北京 102488； 5.大连市中医医院骨科，辽宁 大连 116000)

支气管哮喘是以慢性气道炎症和可逆性气道重塑为特征的异质性呼吸道疾病[1]，主要表现为喘息、胸闷和咳嗽等一系列呼吸系统症状，这些症状随着发病时间和强度的改变而变化，具有呼气气流受限和气道对一系列刺激物(如运动和吸入刺激物)的高反应性等特征[2-3]。目前，西医方面以吸入性皮质类固醇、长效β2肾上腺素能受体激动剂、长效毒蕈碱拮抗剂、白三烯受体拮抗剂以及针对最严重疾病的IgE特异性单克隆抗体Omalizumab为主要治疗手段，尽管这种逐层分类的治疗方法可以改善患者哮喘症状，减少对吸入短效支气管扩张剂的依赖性，但这些治疗方法均无法改变疾病的自然史[3]。

速效平喘合剂是由海派中医儿科徐氏家族第四代传人赵坤教授创制的治疗小儿哮病急性发作的经验方，该方由小青龙汤、三子养亲汤等经典名方化裁改良而成，具有泻肺定喘、降气化痰之功效。临床试验表明，速效平喘合剂对难治型(气道重塑型)哮喘具有较好的疗效[4]，但其治疗哮喘及气道重塑的有效成分与作用机制尚不明确。因此，本研究通过网络药理学的方法探讨速效平喘合剂治疗支气管哮喘、改善气道重塑的关键靶点以及可能通路，再用体内实验验证速效平喘合剂的药效和潜在作用机制，以期为临床使用速效平喘合剂中药制剂治疗支气管哮喘提供理论依据。

1 材料与方法

1.1速效平喘合剂有效成分与潜在靶点筛选 搜索中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https://www.tcmspw.com/tcmsp.php)获取速效平喘合剂中麻黄、白芍、细辛、桑白皮、葶苈子、芥子、紫苏子、莱菔子、款冬花9味中药全部化学成分和靶点，搜索其他文献以完善9味中药成分[5-11]，其中主要有效成分的筛选条件为口服生物利用度≥30%及已知药物的相似性≥0.18。将9味中药的靶点输入Uniprot数据库(https://uniprot.org/)使靶点名称标准化。查阅已有文献获得地龙有效成分，在SwissADME平台(http://www.swissadme.ch/)进行活性成分筛选后，查阅PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)或使用Chemdraw 1.6软件绘图获取地龙活性成分的分子结构式，再通过搜索Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)获得地龙的潜在靶点。

1.2速效平喘合剂靶点-网络构建 将筛选的成分重新编码后，汇总10种中药的成分与靶点，使用Cytoscape 3.8软件绘制药物-成分-靶点网络图并进行网络特征分析，以自由度值作为重要有效成分的依据。

1.3支气管哮喘-气道重塑靶点的收集及药物疾病共同靶点的筛选 以“bronchial asthma”“asthma”和“airway remodeling”为关键词，搜索Genecards(https://www.genecards.org/)、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(https://www.omim.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)等在线数据库，并结合相关文献，汇总去重取交集，获取与支气管哮喘及气道重塑相关的靶点，利用韦恩图绘制平台Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)获取速效平喘合剂、支气管哮喘与气道重塑的药物-疾病的交集靶点。

1.4蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络构建 将速效平喘合剂、支气管哮喘与气道重塑的药物-疾病的交集靶点录入String数据库(http://string-db.org/cgi/input.pl)构建PPI网络，选择分类为人类，置信度≥0.4，导出的tsv文件可使用Cytoscape 3.8软件分析与绘图。筛选核心靶点的标准为自由度、中介中心度、接近中心度及邻里连通性均大于中位数。

1.5基因本体(gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析 应用Metascape数据平台(https://metascape.org/)对核心靶点进行GO、KEGG富集分析，设定P≤0.05，分析速效平喘合剂治疗支气管哮喘-气道重塑潜在的生物过程、细胞结构、分子功能以及信号通路，构建药物-成分-靶点-通路网络并使用Cytoscape 3.8软件绘制其网络。利用微生信在线平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制GO分析条状图以及KEGG富集气泡图。

1.6动物实验

1.6.1实验用药 速效平喘合剂的主要成分为麻黄30 g、白芍100 g、细辛40 g、桑白皮100 g、葶苈子100 g、白芥子65 g、紫苏子100 g、莱菔子150 g、地龙130 g、款冬花120 g。中药药片购自北京中医药大学东直门医院。制备方法参考《中药药理实验方法学》[12]及《中药煎煮法的现代研究概况》[13]中的煎煮提取法制备。醋酸地塞米松片(0.75 mg/片)购自上海信谊有限公司(批号：110302)，使用时按0.075 mg/mL浓度配制成溶液，现配现用。小鼠给药剂量参考《实验动物与动物实验方法学》[14]中的公式计算，小鼠低、中、高给药剂量分别相当于60 kg成人临床剂量的5倍、10倍和20倍。将速效平喘合剂溶于0.9%氯化钠溶液中，用0.22 μm膜过滤后再使用。

1.6.2试剂和仪器 卵白蛋白(美国Sigma公司，批号：A5503)，Al(OH)3(美国Sigma公司，批号：239186),转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)兔多克隆抗体(美国Proteintech公司，批号：21898-1-AP)，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)多克隆抗体(上海碧云天生物技术有限公司，批号：AF797)。相差显微镜(日本奥林巴斯，型号BX51)，显微图像分析系统(日本奥林巴斯，型号VS120-S6)。

1.6.3实验方法 60只无特定病原体级BALB/c小鼠，雌雄各半，4～6周龄，体重18～22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[生产许可证：SCXK(京)2012-0001]。实验动物统一在中国中医科学院医学实验中心动物房的独立送风笼中饲养，温度20～24 ℃，湿度50%～70%，雌雄分开饲养，自由饮水、进食，适应性喂养3 d。动物实验的开展经中国中医科学院实验动物伦理委员会批准。采用随机数字法将60只BALB/c小鼠分为空白组、模型组、阳性组以及速效平喘合剂低、中、高剂量组，每组10只，雌雄各半。

除空白组外，其余小鼠在第1天和第15天接受腹腔注射AL(OL)3/卵白蛋白溶液(1 mL/20 g)和5%卵白蛋白溶液雾化吸入，在第23～29天雾化吸入5%卵白蛋白溶液建模，在造模前与最后一次造模后的15 min内，对各实验组进行打喷嚏、擦鼻动作、呼吸等活动状态进行观察评估以判断造模结果。

在第23～29天进行给药，其中阳性组给予0.1 mg/mL的地塞米松溶液，速效平喘合剂低、中、高剂量组分别予以1、2、4 g浓度梯度速效平喘合剂，空白组和模型组予以等量0.9%氯化钠溶液。在实验第30天进行肺组织取材、4%的甲醛溶液固定、石蜡包埋、石蜡切片，切片后严格按照免疫组织化学染色法进行PPARγ、TGF-β1染色，若出现棕黄色则为PPARγ及TGF-β1表达阳性。

2 结 果

2.1活性成分及有效靶点的筛选 根据设定的条件筛选中药有效成分共119个，靶点816个，每味中药的成分数量如下：地龙36个，款冬花22个，生白芍13个，葶苈子12个，炙麻黄23个，细辛8个，桑白皮31个，芥子1个，莱菔子1个，紫苏子16个，共有成分11个，以拼音首字母重新编码，共有成分编号为GY1～11。采用Cytoscape 3.8绘制速效平喘合剂“药物-成分-靶点”网络，包含973个节点，2 856条边，见图1。主要成分自由度值见表1。

表1 速效平喘合剂主要有效成分基本信息

续表1

2.2药物疾病共有靶点的获取 以“bronchial asthma”和“asthma”为关键词检索，在Drugbank数据库获取1个靶点、Genecards数据库获取861个靶点、OMIM数据库获取12个靶点，合并去重共计874个。以“airway remodeling”为关键词检索，在Drugbank数据库获取靶点663个、Genecards数据库获取1 323个、OMIM数据库获取44个，合并去重共计1 645个。将874个支气管哮喘靶点、1 645个气道重塑靶点与816个速效平喘合剂靶点共同绘制韦恩图取交集，结果得到支气管哮喘-气道重塑交集靶点590个，速效平喘合剂与支气管哮喘-气道重塑交集靶点203个，见图2。

2.3共同靶点PPI网络构建 以自由度≥38、中介中心度≥0.001 485 192、接近中心度≥0.547 425 474、邻里连通性≥74.482 142 86为条件，筛选得出32个核心靶点，PPI网络图见图3。

2.4GO富集分析和KEGG通路分析 GO富集分析结果显示，共得到主要条目中涉及生物过程913条，细胞组成15条，分子功能48条。速效平喘合剂-哮喘-气道重塑交集基因的生物学过程包括细胞因子介导的信号通路、细胞迁移的正调控、骨髓细胞分化等；主要涉及的细胞结构包括膜筏、膜微区、膜区等；主要的分子功能集中于蛋白激酶结合、蛋白质结构域特异性结合、转录因子结合等。见图4。

KEGG通路富集分析共获得78条信号通路(P<0.05)，根据Log(Q)值并结合相关文献筛选得到相关性较强的前20条通路(图5)，每条通路所涉及的基因见表2，其中前3种通路分别为白细胞介素(interleukin，IL)-17、缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路。

表2 KEGG富集分析结果

2.5“药物-成分-靶点-通路”网络的构建 药物-成分-靶点-通路网络图见图6，包含92个节点，264条边，网络分析见表3。

表3 药物-活性成分-靶点-通路网络分析

续表3

2.6免疫组织化学实验验证 与空白组相比，模型组PPARγ和TGF-β1的阳性表达明显；与模型组相比，阳性组及速效平喘合剂低、中、高剂量组PPARγ和TGF-β1的表达呈剂量依赖性降低，与之前网络药理学分析的PPARγ、TGF-β1是速效平喘合剂调控支气管哮喘合并气道重塑的关键靶点这一结果相符。见图7、8。

GO：基因本体；BP：生物学过程；CC：细胞结构；MF：分子功能

绿色圆圈表示药物，蓝色正方形表示药物成分，黄色正方形表示药物共有成分，浅蓝色正八边形表示通路，红色圆形表示治疗关键靶点

PPARγ：过氧化物酶体增殖物激活受体γ

TGF-β1：转化生长因子-β1

3 讨 论

哮喘属中医学中的“哮证”范畴，其基本病机在于“风盛正虚、气逆痰阻”，“风盛”相当于现代医学中引起哮喘急性发作的变应原或呼吸道感染，常作为外因；“痰阻”指出了哮喘之宿根为痰，若阻塞气道可作为哮喘发病的内因。哮喘之痰常以无形之痰为主，故哮喘者每发咳喘痰量不多、难以咯出；顽痰伏于肺络，致气道挛急，故咳嗽喘息频繁。针对“风盛正虚、气逆痰阻”之病机，速效平喘合剂以泻肺定喘、降气豁痰为法，由小青龙汤及三子养亲汤等经典名方加减化裁而成。方中炙麻黄、白芍一散一收，宣肺敛气平喘；葶苈子治痰壅喘咳，与芥子、紫苏子合而为用，降气消痰；细辛温阳化饮，款冬花润肺化痰止咳，增强化痰之效；地龙咸寒，宁肝熄风，解痉平喘。全方降气平喘，清热化痰，降气平喘，共奏理肺平喘之功。

本研究首先用TCMSP数据库及SwissADME平台筛选出速效平喘合剂中的主要有效化合物119个，主要包括槲皮素、木犀草素、二氢辣椒素、β-谷甾醇、花生四烯酰胺、18-羟基二十碳五烯酸、14,8,5-二十碳酰胺、山柰酚、β-胡萝卜素及柚皮素等。上述化学成分具有抑制哮喘气道慢性炎症反应、调节气道高反应、改善气道重构的作用，尤其在抑制气道炎性方面作用明显。如木犀草素能调节诱导型一氧化氮合酶/一氧化氮信号通路，从而减轻哮喘幼鼠气道炎症，同时还能抑制促分裂原活化的蛋白激酶激酶/胞外信号调节激酶1/2信号通路，从而抑制气道重塑[15-16]；槲皮素通过抑制哮喘大鼠IL-5、IL-6、嗜酸粒细胞、IgE等炎症细胞和炎症因子水平，提高机体γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)的表达[17-18]。

本研究根据基因交集PPI网络得到速效平喘合剂治疗哮喘及气道重塑的核心靶点共32个，主要包括促分裂原活化的蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14)、IFN-γ、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HMOX1)及信号转导及转录激活因子1(signal transduction and activator of transcription 1，STAT1)等。其中，IFN-γ参与哮喘发生发展过程被广泛研究，其能特异性负反馈调节气道的过敏性免疫反应[19]。此外，有研究表明哮喘大鼠气道慢性炎症、气道高反应性及气道重塑三大特点均与mTOR异常表达有关[20]。同时，有研究表明哮喘患儿外周血STAT1 mRNA表达升高可增加嗜酸粒细胞百分比，加重哮喘发作的炎症反应[21]。

本研究通过GO富集分析发现速效平喘合剂基因靶点集中在细胞迁移、细胞对激素及生长因子刺激等反应，以及与DNA或蛋白质结合、细胞因子及泛素样蛋白连接酶结合等相关的生物学过程上。而通过KEGG通路富集分析得知与哮喘及气道重塑密切的靶点主要富集在IL-17、HIF-1及PI3K/Akt信号通路上，表明速效平喘合剂可能通过相关靶基因来调节所对应信号通路，从而调控免疫，抑制气道重构，发挥治疗哮喘的作用。研究表明，IL-17信号通路下游蛋白Th17能通过加强气道炎症及气道高反应性引起或加重哮喘[22-24]。PI3K/Akt信号通路通常与细胞的增殖、转移、分化、凋亡等过程密切相关[25]。有研究报道，PI3K/Akt信号通路的激活促进哮喘气道重塑，也是成人哮喘发作期炎症反应强弱的决定因素[26-28]。HIF-1是一种重要的转录因子，机体的缺血缺氧环境诱导其产生[29]。研究表明，哮喘发作时的缺氧环境导致HIF-1在哮喘肺组织中的表达增强[30]。此外，HIF-1通过免疫调节、能量代谢、炎症反应、血管生成等途径诱使和促进哮喘患者气道重塑的产生[31]。

本研究通过建立哮喘大鼠模型，用免疫组织化学法验证速效平喘合剂治疗支气管哮喘大鼠疗效及网络药理学预测机制的准确性。PPARγ是本研究所得出的关键靶点，其是配体激活的核转录因子，主要参与机体慢性炎症和免疫反应[32]。TGF-β1是一种前纤维化生长因子，能够影响成纤维细胞和相关蛋白的合成，引发并维持哮喘气道重塑[33]。本实验结果表明，免疫组织化学法检测结果与网络药理学预测结果一致，即PPARγ及TGF-β1为速效平喘合剂治疗支气管哮喘和气道重塑的潜在靶点。

综上所述，速效平喘合剂可能通过槲皮素及木犀草素等有效成分作用于MAPK14、HMOX1、IFN-γ、mTOR及STAT1等靶点，通过调节细胞迁移、细胞对激素及生长因子刺激等反应，以及与DNA或蛋白质结合、细胞因子及泛素样蛋白连接酶结合等相关的生物学过程，干预HIF-1及PI3K/Akt等信号通路，抑制哮喘气道慢性炎症和气道重塑。