高寒地区6 种禾本科牧草对低温胁迫的生理响应及耐寒性评价

何子华，杨成行，王 沛，包爱科，马 清

（兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020）

低温胁迫是世界范围内造成作物减产和品质下降的主要非生物因子之一[1]。我国西北地区由于特有的大陆性季风气候，干旱少雨且冬夏极端气温差异较大，因此水分和温度成为影响该地区植物生长的主要环境因子[2-3]。对于我国西北高寒草甸草原而言，由于高海拔导致冬季寒冷，植物的安全越冬受到严重阻碍，并且春秋季节气温不稳定致使植物生长不良，进而导致植被严重退化[2]。可见，低温是限制高寒草原地区多数植物正常生长最主要的环境因素[2-3]。因此，筛选具有较强耐寒性的植物是对高寒草地进行生态修复的关键。

植物耐寒性是长期生活在寒冷条件下的植物适应或抵御低温胁迫的能力，耐寒性强的植物在低温胁迫下具有特殊或高效的抵御低温胁迫的生理适应机制，从而维持其正常生长发育和生理代谢功能[4]。植物耐寒性受多种因素影响，近年来众多研究常采用叶绿素含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、丙二醛(malondialdehydem,MDA)含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量等生理生化指标评价植物耐寒性。在低温胁迫条件下，由于低温导致的酶活性降低、叶绿体及多种细胞内膜系统结构破坏，使得植物叶绿素含量降低，光合作用受阻[5-7]；低温胁迫还会引起植物体内活性氧自由基的大量积累，诱导膜脂过氧化并产生MDA，因此MDA的含量可反映植物细胞膜系统的受损程度[8-11]；SOD 是植物活性氧清除系统中的关键酶之一，可协同清除植物在逆境条件下产生的大量活性氧自由基，保护植物免受伤害[12-14]；可溶性糖和脯氨酸是细胞内两种重要的渗透调节物质[15-16]，能通过增加细胞保水能力和稳定细胞内的代谢过程来提高植物的耐寒性[16-18]，大量研究表明，可溶性糖和脯氨酸的含量与植物的耐寒性具有显著的正相关关系[12,19-23]。然而，由于植物耐寒指标和生理适应机制的多样性，分析单一指标往往不能真实反映植物的耐寒性强弱，因此利用隶属函数法综合分析其耐寒性相关指标，能较为全面地评价和比较植物耐寒性[9,12-13]。

禾本科牧草是高寒地区经济价值最大、种类最多、分布最广的天然草地植物资源[24]。由于甘南等西北高寒地区年平均气温约为4 ℃，其中夏季平均气温仅8～14 ℃[25]，使得高寒地区禾本科牧草的生长常年面临着低温胁迫。因此，研究和评价重要禾本科牧草耐寒性并进一步筛选出优质的抗寒种质资源，对高寒地区生态环境修复、畜牧业可持续发展以及抗寒品种选育均具有重要的理论和实践意义。景美玲[26]对青藏高原等高寒地区引进或育成的16 种多年生禾本科牧草品种的形态学特征、生产性能和越冬率等进行了比较研究，确定了青牧一号老芒麦(Elymus sibiricus‘Qingmu No.1’)、青海冷地早熟禾(Poa crymophila‘Qinghai’)、青海扁茎早熟禾(P. pratensisvar. anceps Gaud ‘Qinghai’)、青海中华羊茅(Festuca sinensis‘Qinghai’)、同德短芒披碱草(E. breviaristatus‘Tongde’) 和 同 德 老 芒 麦(E.sibiricus‘Tongde’)等适宜在高寒地区推广种植的牧草品种，但关于上述牧草品种对低温胁迫的生理响应和耐寒性综合评价的研究尚未见报道。鉴于此，本研究以高寒地区草地恢复建植中主推的6 种禾本科牧草[26]为材料进行低温胁迫处理，分析和比较了其生物量、叶绿素含量、MDA 含量、SOD 活性、可溶性糖含量和脯氨酸含量的变化，并利用隶属函数法综合评价了6 种禾本科牧草耐寒性，以期筛选出耐寒性强的禾本科牧草品种，为高寒地区天然草地的恢复建植奠定重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本研究所用的6 种牧草品种青海扁茎早熟禾、青海冷地早熟禾、同德老芒麦、青牧一号老芒麦、青海中华羊茅和同德短芒披碱草均为国家牧草审定委员会登记并适合青藏高原等高寒地区推广种植的多年生禾本科牧草[26]，种子由青海大学刘文辉研究员赠送。

1.2 试验设计

采用盆栽法，按照15 g·m−2的密度均匀撒播于以蛭石为基质的塑料营养钵(17 cm × 15 cm)中。盆栽苗放于昼夜温度为28 ℃/23 ℃、光照时长为16 h·d−1、 光 强 约 为800 μmol·(m2·s)−1、 相 对 湿 度为65%的人工气候箱中，使用1/2 Hoagland 营养液(1 mmol·L−1KNO3，0.25 mmol·L−1Ca(NO3)2·4 H2O，0.25 mmol·L−1MgSO4·7 H2O，0.25 mmol·L−1KH2PO4，0.03 mmol·L−1Fe-citrate·3 H2O，50 μmol·L−1H3BO3，10 μmol·L−1MnCl2·4 H2O，0.05 μmol·L−1Na2MoO4·2 H2O，1.6 μmol·L−1ZnSO4·7 H2O，0.6 μmol·L−1CuSO4，pH 5.8)进行培养，每3 d 添加适量营养液以使基质含水量始终维持在70%田间最大持水量。

培养1 个月后，选取生长良好的各品种植株分为2 组，分别置于25 ℃(对照组)和0 ℃(低温胁迫处理组) 的人工气候箱进行处理。处理期间每3 d 添加适量营养液使基质含水量维持在70%田间最大持水量。3 周后，取样测定相关生理生化指标。所有处理设6 个重复。

1.3 指标测定及方法

剪取各处理组材料叶片，蒸馏水冲洗3 次后，用滤纸将表面水分迅速吸干并称取鲜重，随后置于105 ℃的烘箱中杀青10 min，再于80 ℃下烘干48 h，放入干燥器中冷却至室温，取出材料称取干重。采用乙醇热浸法测定叶绿素含量[27-28]，氮蓝四挫法测定叶中SOD 酶活性[29]，硫代巴比妥酸法测定叶中MDA 含量[29]，酸性茚三酮法测定叶中脯氨酸含量[27-28]，蒽酮比色法测定叶中可溶性糖含量[27-28]。依照如下公式计算低温胁迫下各指标的变化幅度[30-31]：

1.4 耐寒性综合评价方法

采用模糊数学的隶属函数法评价试验材料耐寒性，并通过如下公式对各类指标的隶属函数值进行计算，然后对6 种禾草的耐寒性进行综合评价。为消除不同禾本科牧草种间遗传背景的差异，采用各指标的变化幅度计算隶属函数值[30-31]。如果指标与耐寒性正相关，隶属函数值的计算采用公式(1)，如果指标与耐寒性负相关，则采用公式(2)[32-35]。利用上述公式得出6 种禾本科牧草各指标隶属值的平均值，并进行比较，平均值越大则植物的耐寒性越强。

式中：Zij表示i品种j指标的隶属函数值，Xij表示i品 种j指 标 的 测 定 值，Xjmax和Xjmin表 示 各 品种j指标的最大值和最小值。

1.5 数据分析

采用Excel 2010 制图，SPSS 25.0 软件对数据进行独立样本t检验。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫下6 种禾本科牧草的长势变化

低温胁迫处理3 周后，6 种禾本科牧草的长势均明显弱于对照组(图1)，表明低温胁迫对6 种禾本科牧草的生长均产生不同程度的抑制。

图1 低温胁迫下6 种禾本科牧草长势对比Figure 1 Growth status of six species of grasses under low-temperature stress

2.2 低温胁迫下6 种禾本科牧草各指标变化

低温胁迫下，6 种禾本科牧草的鲜重和干重与各自对照相比均显著下降(P< 0.05)；相比而言，青海扁茎早熟禾、青海冷地早熟禾和青牧一号老芒麦的鲜重和干重降幅较低，其中，青海冷地早熟禾鲜重降幅最小，而青牧一号老芒麦的干重降幅最小(图2)。

图2 低温胁迫下6 种禾本科牧草的鲜重和干重变化Figure 2 Changes in the fresh weight and dry weights in six species of grasses under low-temperature stress

与对照处理相比，低温胁迫下6 种禾本科牧草的叶绿素含量均显著下降(P< 0.05)；其中，青海中华羊茅和同德老芒麦叶绿素含量降幅较低，分别下降了34.1% 和36.1%，而青海扁茎早熟禾和同德短芒披碱草的叶绿素含量降幅较大，分别降低了64.3%和58.2% (图3)。表明，相较于其他禾本科牧草，低温胁迫对青海中华羊茅和同德老芒麦叶绿素合成的影响相对较小。

图3 低温胁迫下6 种禾本科牧草的叶绿素含量、丙二醛含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性变化Figure 3 Changes in chlorophyll content, MDA content, soluble sugar content, proline content and SOD activity in six species of grasses under low temperature stress

低温胁迫下，植物体内会产生大量活性氧自由基，诱导膜脂过氧化，产生大量MDA[8-9,19]。与对照相比，低温胁迫下6 种禾本科牧草叶中MDA 含量均呈增加趋势，其中青牧一号老芒麦和青海冷地早熟禾与对照相比差异不显著(P> 0.05)，且青牧一号老芒麦MDA 含量增幅最小，仅为8.6%；而青海扁茎早熟禾、同德老芒麦、青海中华羊茅和同德短芒披碱草叶中MDA 含量比各自对照分别显著增加了18.4%、76.2%、43.2%和37.2% (P< 0.05)。由此可知，低温胁迫下青牧一号老芒麦叶组织细胞膜脂受到的伤害最小。

低温胁迫下，青牧一号老芒麦、青海中华羊茅和青海冷地早熟禾叶中可溶性糖含量较对照处理显著增加(P< 0.05)，增幅分别为84.0%、65.0%和43.4%，其余3 种禾本科牧草叶中可溶性糖含量与对照相比虽有10%左右的增幅，但差异并不显著(P>0.05)。这表明，青牧一号老芒麦、青海中华羊茅和青海冷地早熟禾在低温胁迫下可通过积累可溶性糖以进行渗透调节，缓解低温胁迫造成的伤害。

相较于对照处理，低温胁迫下6 种禾本科牧草叶中脯氨酸含量均显著增加(P< 0.05)，其中青牧一号老芒麦、同德老芒麦和青海中华羊茅在低温胁迫下脯氨酸含量较高，且增幅也较大，分别显著增加了535.2%、433.0%和387.1% (P< 0.05)。这表明，上述3 种禾本科牧草可在低温胁迫下大量积累脯氨酸，以维持细胞内较低的渗透势。

SOD 作为植物活性氧清除系统中的关键酶之一，其活性是反映植物抗寒能力的一个重要指标[12-13]。相较于对照处理，低温胁迫下青牧一号老芒麦叶中SOD 活性显著增加了37.6% (P< 0.05)；其余5 种禾本科牧草叶中SOD 活性较对照无显著变化(P>0.05)。这表明，增加叶中SOD 酶活性以清除大量活性氧可能是青牧一号老芒麦抵御低温胁迫的一种重要机制。

2.3 6 种禾本科牧草耐寒性综合评价

计算上述生理生化指标的变化幅度在不同牧草品种中的隶属函数值，并以各指标的平均隶属值作为确定6 种禾本科牧草耐寒性强弱的综合评价指标(表1)。根据隶属函数值越大、耐寒性越强的评价原则可以看出，青牧一号老芒麦隶属值为0.915，在6 种禾本科牧草中最高，其耐寒性最强；同德老芒麦隶属值为0.321，其隶属值最低，耐寒性最弱。6 种禾本科牧草耐寒性强弱顺序依次为青牧一号老芒麦 > 青海中华羊茅 > 青海冷地早熟禾 > 青海扁茎早熟禾 > 同德短芒披碱草 > 同德老芒麦。

表1 6 种禾本科牧草抗寒性各指标隶属函数值及评价值Table 1 Subordinate function value and evaluation value of each index of cold resistance of six species of grasses

3 讨论

3.1 叶绿素与6 种禾本科牧草耐寒性的关系

在低温胁迫下，叶绿体的超微结构被破坏，叶绿素合成酶的活性显著降低，导致叶绿素含量下降[5-7,36]。严青等[7]在3 种牧草幼苗耐寒生理指标的研究中发现，0 ℃低温处理下，随着处理时间的延长，3 种牧草叶绿素含量逐渐减少，且耐寒性最弱的垂穗披碱草的叶绿素含量下降幅度最大。因而，叶绿素含量的变化可作为评判植物耐寒性的重要指标。叶绿素含量在低温胁迫下的变化越小，表明植物在低温条件下叶绿体结构受到的伤害越小，植物的耐寒性越强[5-7]。本研究中，与对照处理相比，低温胁迫下6 种禾本科牧草的叶绿素含量均显著降低(P< 0.05)，其中，青海冷地早熟禾、同德老芒麦、青牧一号老芒麦、青海中华羊茅的叶绿素含量降幅远小于青海扁茎早熟禾和同德短芒披碱草的叶绿素含量降幅(图3)。因此，依据叶绿体损伤程度判断，低温胁迫下青海冷地早熟禾、同德老芒麦、青牧一号老芒麦、青海中华羊茅的耐寒性较强。

3.2 丙二醛(MDA)和过氧化物歧化酶(SOD)与6 种禾本科牧草耐寒性的关系

正常生理条件下，植物体内活性氧的产生反应与清除系统保持一定的平衡，以保护植物体免受活性氧的伤害；而在低温胁迫下，植物氧代谢受到干扰，产生大量活性氧自由基，诱导细胞膜脂发生过氧化作用，产生大量MDA[8-9]。同时，为保护细胞膜免受活性氧伤害，SOD 等细胞膜保护酶的活性也相应升高[22,37-38]。有研究表明，植物遭受的低温胁迫程度越高，细胞膜脂过氧化作用越强，其体内MDA含量也越高，因此MDA 的含量与膜损伤程度呈显著的正相关关系[19]。张尚雄等[19]研究发现，同德老芒麦在低温胁迫下MDA 含量急剧增加，增加幅度远大于其他材料，说明同德老芒麦的抗寒能力相对较弱，这与本研究结果相符(图3)；李卓夫等[39]发现，随低温胁迫处理温度的下降，小麦(Triticum aestivum)体内SOD 活性均快速上升；翟飞飞等[20]研究发现，耐寒性强的多年生黑麦草(Lolium perenne) SOD 活性变化率较大。可见，植物耐寒性与其SOD 活性水平有重要关系。耐寒性强的植物在低温胁迫下可维持较高的SOD 活性，以清除植物产生的大量活性氧自由基，维持植物体内氧代谢机制的平衡，增强膜脂抗氧化能力，导致MDA 含量下降[21,39]。本研究中，青牧一号老芒麦在低温胁迫下的MDA 含量较对照无显著性增加(P> 0.05)，增幅也最低，同时SOD 活性在低温胁迫下显著增强(P<0.05)，且增幅高于其他5 种禾本科牧草(图3)。据此可推断，青牧一号老芒麦可能具有更强的耐寒性。

3.3 可溶性糖和脯氨酸与6 种禾本科牧草耐寒性的关系

可溶性糖和脯氨酸作为多数植物体内两种重要的渗透调节物质，其含量高低常被用作判断植物耐寒性强弱的重要指标[21]。植物在低温胁迫下，可溶性糖和脯氨酸大量积累，使细胞液的浓度急剧增高[21-22]，细胞渗透压的增高使细胞不易脱水，冰点下降，降低了低温胁迫对植物的伤害[18]。研究表明，可溶性糖和脯氨酸能降低细胞渗透势，并有稳定和保护生物大分子的功能，其含量的高低与植物的耐寒性呈正相关关系[23-24]。田彦锋等[21]在草地早熟禾耐寒性的研究中发现，植株可溶性糖和脯氨酸含量均随低温胁迫时间的延长逐渐增加；同样，张尚雄等[19]的研究中，在低温胁迫下两种耐寒性较强的披碱草属牧草可溶性糖和脯氨酸含量均显著增加(P<0.05)。可见，在低温胁迫下，植物体内可溶性糖和脯氨酸的含量增加越多，其耐寒性越强[40-41]。本研究中，低温胁迫下，6 种禾本科牧草可溶性糖含量增幅由高到低依次是青牧一号老芒麦、青海中华羊茅、青海冷地早熟禾、青海扁茎早熟禾、同德老芒麦和同德短芒披碱草，而脯氨酸含量增幅由高到低依次是青牧一号老芒麦、同德老芒麦、青海中华羊茅、青海扁茎早熟禾、同德短芒披碱草和青海冷地早熟禾(图3)。由此可知，在低温处理下青牧一号老芒麦和青海中华羊茅的两种主要渗透调节物质含量增幅都较高，这表明，这两种禾本科牧草可能具有更高效的渗透调节机制，以增强其耐寒性。

3.4 6 种禾本科牧草耐寒性的综合评价

由于不同植物间耐寒机制存在差异、且耐寒性受多种指标综合影响，采用单个指标评价植物耐寒性具有片面性[12]。因此，常采用隶属函数法等综合指标评价方法比较植物耐寒性[42-43]，近年来相关研究中多使用隶属函数法评价禾本科牧草耐寒性[12,19,44-45]，如贾祥等[12]采用隶属函数法评价了4 种禾本科牧草耐寒性，结果表明垂穗披碱草(Elymus nutans)和紫花针茅(Stipa purpurea)耐寒性最强，赖草(Leymus secalinus)耐寒性中等，黑麦草耐寒性最弱。本研究亦采用隶属函数法计算了6 种禾本科牧草在低温胁迫下鲜重、干重、叶绿素含量、SOD 活性、MDA 含量、游离脯氨酸含量、可溶性糖含量7 种指标的隶属函数值，并依据该值对6 种禾本科牧草的耐寒性进行综合评价，使评价结果更能全面反映6 种禾本科牧草实际抗寒能力。根据其耐寒性综合评价排序结果，青牧一号老芒麦的耐寒性最强，青海中华羊茅次之，青海冷地早熟禾和青海扁茎早熟禾耐寒性中等，同德短芒披碱草和同德老芒麦耐寒性较弱。

4 结论

本研究通过比较青牧一号老芒麦、同德老芒麦、同德短芒披碱草、青海冷地早熟禾、青海扁茎早熟禾和青海中华羊茅6 种禾本科牧草在0 ℃低温胁迫下鲜重、干重、游离脯氨酸含量、可溶性糖含量、叶绿素含量、SOD 活性和MDA 含量等生理指标的变化，并通过隶属函数值法综合评价了它们的耐寒性。主要结论如下：

1) 0 ℃低温胁迫下，6 种禾本科牧草的生长均受到不同程度的抑制，其中，青海冷地早熟禾鲜重降幅最小，青牧一号老芒麦的干重降幅最小。

2) 与25 ℃对照相比，0 ℃低温胁迫下6 种禾本科牧草叶绿素含量均呈下降趋势，而MDA 含量、SOD 活性、可溶性糖含量和脯氨酸含量均呈增加趋势。

3) 运用隶属函数法的综合评价表明，6 种禾本科牧草耐寒性强弱依次为青牧一号老芒麦 > 青海中华羊茅 > 青海冷地早熟禾 > 青海扁茎早熟禾 >同德短芒披碱草 > 同德老芒麦。