寒喘祖帕颗粒治疗哮喘的潜在物质基础及作用机制的网络药理学研究*

范晨阳，马 璇，季志红，李柯翱，李治建

（1.新奇康药业股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011；3.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，新疆 乌鲁木齐 830011）

哮喘（Asthma）又名支气管哮喘，是由多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症，其特征是支气管对多种刺激的反应性增加，导致空气通道变窄，从而导致呼吸困难、咳嗽和喘息。《中成药临床用药指南·呼吸系统疾病分册》指出哮喘发作期冷哮证可选用的中成药有3个，即寒喘祖帕颗粒、小青龙胶囊和桂龙咳喘宁胶囊。哮喘发作期冷哮证证见喉中哮鸣如水鸡声，呼吸急促，喘憋气逆，胸膈满闷如塞，咳不甚，痰少咯吐不爽，色白而多泡沫，口不渴或渴喜热饮，天冷或受寒易发，面色晦滞，或有恶寒，发热，身痛。舌质淡，苔白滑，脉浮紧或弦紧。寒喘祖帕颗粒出自1336年艾克木·穆哈穆德·努尔编著的《贾米依拉基》，1998年被载入《中华人民共和国卫生部药品标准（维吾尔药分册）》，是国家基本药物、国家医保品种。处方中含有小茴香、芹菜子、神香草等维药。其功能为镇咳、化痰、温肺止喘，用于急性感冒、寒性乃孜来所致的咳嗽及异常黏液质性哮喘。乃孜来系指产生于脑部，具有流动性、致病性的积液。乃孜分为寒性和热性两种，流入呼吸道可引起肺部炎性疾病；流入消化道可引起胃肠道糜烂等。乃孜来泛指病毒、细菌等致病因素。异常黏液质系人体功能不正常时出现的异常体液，黏液质体液偏盛的人为湿寒性气质，此类人的面色、眼睛及舌面较白，机体松弛而肥胖，嗜睡，流涎水，脉大而缓，尿多，尿色清[1]。

药理试验结果显示，寒喘祖帕颗粒具有止咳、祛痰、平喘、抗炎、肺保护的作用[2-4]。余通等[5]对寒喘祖帕颗粒治疗呼吸系统疾病有效性进行Meta分析，纳入了897例患者，结果显示其能明显降低气喘、咳嗽、肺音时间，改善TNF-α水平，明显改善患者肺部功能。其联合布地奈德福莫特罗、沙丁胺醇可用于治疗支气管哮喘，联合沙美特罗替卡松粉吸入剂可以减少和预防慢性阻塞性肺疾病急性加重，提高患者生活质量[6-9]。其辅助治疗小儿咳嗽变异性哮喘疗效显著[10-13]。综上所述，寒喘祖帕颗粒治疗支气管哮喘具有显著的疗效，然而其具体的体内代谢机制尚不明确，本研究拟通过网络药理学分析探讨寒喘祖帕颗粒中治疗哮喘的物质基础与效应机制。

1 方 法

1.1 寒喘祖帕颗粒9个药物的成分收集与筛选 中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）是一个独特的中草药系统药理学平台，可以捕捉药物、中药成分、成分靶点和疾病之间的关系。该数据库包括502个中药，13 729个化学成分和3 339个靶点，以及口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、类药性（drug-likeness，DL）、肠上皮通透性、血脑屏障、水溶性等化合物的药代动力学特性。本研究以OB≥30%为条件[14]，筛选可被口服吸收的候选生物活性成分。其中，神香草、芸香草、铁线蕨、荨麻子、芹菜子、葫芦巴为维吾尔医药常用药物，未收录在TCMSP数据库中，故采用在中国知网上查询已发表的文献进行化学成分的搜集，然后利用TCMSP数据库以OB≥30%为条件进行候选生物活性成分的筛选。

1.2 寒喘祖帕颗粒候选生物活性成分的靶点预测UniProt（https://www.uniprot.org/）是一个高质量且可免费访问的蛋白质序列和功能信息的数据库，UniProt每4周更新一次。本研究利用TCMSP数据库中的靶点预测功能搜集寒喘祖帕颗粒中化学成分的靶点蛋白[15]，借助Uniprot数据库，通过导入蛋白名称并限定物种为人，检索得到所有蛋白靶点对应的基因名。

1.3 哮喘相关靶点的收集DisGeNET是一个人类疾病相关的公开基因和变体数据库。人类表型本体论（Human Phenothpe Ontology，HPO）数据库提供了人类疾病中遇到的表型异常的标准词汇表，HPO目前包含13 000多个术语和156 000多个遗传性疾病注释。DrugBank数据库是一个独特的生物信息学和化学信息学资源，DrugBank于2020年4月22日更新的数据包含13 575个药物，2 632种经批准的小分子药物，1 377种经批准的生物制剂，131种营养保健品和6 375多种实验阶段药物，以及5 238个非冗余蛋白。GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库是一个支持MIAME兼容数据提交的功能基因组学数据库，用户可以查询和下载论文中实验过程涉及的基因表达谱。

通过以上4个平台进行哮喘相关靶点的搜集，以“asthma”为关键词分别在DisGeNET平台、HPO数据库、DrugBank数据库和GEO数据库搜索哮喘相关靶点，对结果进行整理，删除重复项与无效项。

1.4 构建寒喘祖帕颗粒药物-成分-靶点-疾病网络与PPI网络 将“1.3”项下获得的哮喘相关基因与“1.2”项下获得的药物成分靶点取交集，得到寒喘祖帕颗粒治疗哮喘的潜在靶点。利用Cytoscape 3.7.2软件进行药物-成分-靶点-疾病网络的构建与可视化，利用Cytoscape 3.7.2软件中的插件Bisogenet对潜在靶点进行蛋白互作网络（protein-protein interaction network，PPI）的构建。

1.5 GO富集分析与KEGG通路富集分析 为进一步阐明潜在靶点的生物学活性，利用Rx64 3.6.2软件对“1.4”项下获得的潜在靶点进行基因本体论富集分析（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书信号通路富集分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），设定阈值P≤0.05，筛选具有显著性差异的生物过程和靶点，P值越小，富集显著程度越高。

2 结 果

2.1 寒喘祖帕颗粒9个药物的活性成分与靶点 按照“1.1”项下方法共检索得到9个药物的564个化学成分，以OB≥30%为条件进行候选生物活性成分的筛选，获得候选活性成分390个，将筛选出的活性成分输入到TCMSP数据库，查询其作用靶点，将查询到的作用靶点输入到UniProt平台，获得作用靶点的基因名。去除9个药物共有成分和靶点，共获得9个药物，300个活性成分，374个靶点。（见表1）

表1 寒喘祖帕颗粒活性成分靶点汇总

2.2 哮喘相关基因 根据“1.3”项下方法，在4个数据库收集哮喘相关靶点，其中DisGeNET平台1 312个、HPO数据库113个、DrugBank数据库293个和GEO数据库499个，去除重复，共获得哮喘相关基因1 930个。

2.3 寒喘祖帕颗粒治疗哮喘的潜在基因 将哮喘相关基因与寒喘祖帕颗粒活性成分靶点基因取交集，得到寒喘祖帕颗粒治疗哮喘的潜在基因结果。（见图1）87、43、36、34、27、25、22、22、20、20；网络中度值排名前10位的基因分别是PTGS2、PTGS1、ESR1、HSP90AA1、CHRM1、CALM1、AR、NOS2、PPARG、ADRB2度值分别为171、102、84、78、78、75、72、70、69、68，度值相对较高，为网络中的关键节点。（见图2）

图1 寒喘祖帕颗粒与哮喘基因交集韦恩图

图2 寒喘祖帕颗粒治疗哮喘的药物-成分-靶点-疾病网络图

2.5 蛋白相互作用网络分析 将“2.4”项下获得的166个交集靶点基因导入到Cytoscape 3.7.2软件中的插件BisoGenet中，对关键靶点进行蛋白相互作用网络的构建，蛋白相互作用网络数据来自于蛋白相互作用数据库（Database of Interacting Protein，DIP）、生物通用交互数据集库（Biological General Repository for Interactionh Datasets，BioGRID）、人类蛋白质参考数据库（HumanProteinReferenceDatabase，HPRD）、完整的分子相互作用数据库（IntAct Molecular Interaction Database，IntAct）、分子相互作用数据库（Molecular INTeraction database，MINT）、生物分子相互作用网络数据库（biomolecular interaction network database，BIND）。结果显示靶点间存在直接或间接作用。（见图3）

图3 寒喘祖帕颗粒与哮喘交集靶点的PPI网络图

2.4 寒喘祖帕颗粒治疗哮喘的药物-成分-靶点-疾病网络图 根据“1.4”项下方法，将寒喘祖帕颗粒中与治疗哮喘相关的基因和成分导入到Cytoscape 3.7.2软件中，构建药物-成分-靶点-疾病网络图，网络包含429个节点和2 241条边。根据网络的拓扑学性质度值排序确定关键节点，网络中成分度值中位数为7，基因度值中位数为2，度值大于等于2倍中位数的成分有44个，基因有59个。网络中度值排名前10位的成分分别是MOL000098-槲皮素、MOL000422-山柰酚、MOL008680、MOL000006-木犀草素、MOL000254、MOL003896-7-甲氧基-2-甲 基 异 黄 酮、MOL002467、MOL000358-β-谷 甾 醇、MOL004328-柚皮素、MOL002565-美迪紫檀素，度值分别为

2.6 GO富集分析与KEGG通路富集分析 运用Bioconductor生物信息软件包，借助R语言对“2.4”项下获得的166个交集靶点基因进行GO功能富集分析，855个GO项被显著富集（P＜0.001），其中783个项在生物过程（BP）中显著富集，16个项在细胞组成（CC）中显著富集，56个项在分子功能（MF）中显著富集，占比分别为92%、2%、6%。前20项显著富集的生物过程、细胞组成和分子功能结果见图4。GO富集分析主要集中在生物过程（BP）中，主要涉及对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、对细菌来源分子的反应（response to molecule of bacterial origin）、细胞对药物的反应（cellular response to drug）、对外源刺激的反应（response to xenobiotic stimulus）；细胞组成（CC）主要涉及脂膜筏（membrane raft）、脂膜微结构域（membrane microdomain）和脂膜区（membrane region）；分子功能（MF）主要涉及G蛋白偶联胺受体活性（G protein-coupled amine receptor activity）、核受体活性（nuclear receptor activity）、转录因子活性，直接配体调节的序列特异性DNA结合（transcription factor activity，direct ligand regulated sequence-specific DNA binding）。

图4 寒喘祖帕颗粒治疗哮喘作用靶点的GO富集分析的前20个项

运用Rx64 3.6.2对“2.4”项下获得的166个交集靶点基因进行KEGG通路富集分析，得到110条信号通路（P＜0.001），涉及百日咳（Pertussis）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathw）和肿瘤坏死因子信号途径（TNF signaling pathway）等。（见图5）

图5 寒喘祖帕颗粒治疗哮喘作用靶点的KEGG富集分析的前20个通路

2.7 基因通路网络分析 基因通路网络是基于显著富集的KEGG通路和调控这些通路的基因构建的。将“2.4”项下获得的166个交集靶点基因与“2.6”项下获得的KEGG通路导入Cytoscape 3.7.2中，得到寒喘祖帕颗粒治疗哮喘的基因通路网络（见图6）。用BC（Betweenness Centrality）对110条通路和涉及的139个基因进行了拓扑分析。红色表示网络中的通路，绿色表示参与通路的基因。节点大小与BC成正比。网络图显示MAPK1的BC最大，是调控信号通路的核心基因，其他几个基因也有较大的BC，如MAPK3、RAF1、RELA、MAPK9、MAPK8、JUN、MAPK14、EGFR和IL-6。它们可能是寒喘祖帕颗粒治疗哮喘的主要基因。

图6 寒喘祖帕颗粒治疗哮喘的基因通路网络图

参 与 哮 喘 的KEGG通 路 包 括hsa04660、hsa04514、hsa04612、hsa04060、hsa04630、hsa04662和hsa04664[16]，分析寒喘祖帕颗粒治疗哮喘的基因通路网络图发现，其包含hsa04660、hsa04630和hsa04664。其中hsa04660为T细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway），T淋巴细胞的激活是免疫系统有效反应的关键事件，外源抗原与T细胞受体（TCR）结合，导致一系列信号级联，如蛋白酪氨酸激酶、磷酸酶、GTP结合蛋白和衔接蛋白等的功能激活，从而导致T细胞增殖分化为效应细胞[17]。hsa04630为JAK-STAT信号通路（JAK-STAT signaling pathway），JAK-STAT通路是多种细胞因子和生长因子的主要信号机制，其作用是促进发育和体内平衡。细胞因子与其同源受体结合后，酪氨酸激酶JAK家族成员激活STATs，激活后的STATs被转移到细胞核，调节靶基因的表达。除了STATs的激活外，JAKs还介导MAP激酶、PI3激酶等细胞因子的募集。这些因子通过Ras-Raf-MAP激酶和PI3激酶通路处理下游信号，从而激活额外的转录因子[18]。hsa04664为Fc-epsilon-RI信号通路（Fc epsilon RI signaling pathway），Fc-epsilon-RI通路介导的肥大细胞信号通路是由抗原（Ag）与IgE结合在Fc-epsilon-RIα链胞外区的相互作用启动的。激活通路受多种信号分子相互作用的正负调控。因此被激活的肥大细胞释放含有生物胺（特别是组胺）和蛋白多糖（特别是肝素）的介质。磷脂酶A2的激活导致膜脂的释放，随后产生脂质介质，如白三烯（LTC4、LTD4和LTE4）和前列腺素（PDG2）。同时分泌细胞因子，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4和白细胞介素-5。这些介质和细胞因子促进炎症反应[19]。

3 讨 论

哮喘的发病机制一般认为是吸入性变应原与气道内的抗原递呈细胞（antigen presenting cells，APC）相遇，在抗原识别和APC激活后，原始T细胞分化为TH2细胞。活化的TH2细胞刺激B细胞形成免疫球蛋白E（Immunoglobulin E，IgE）。IgE分子与肥大细胞上的IgE受体结合，变应原交联肥大细胞结合的IgE导致生物活性介质（组胺、白三烯）的释放，从而导致过敏的直接症状。肥大细胞同时释放趋化因子，趋化因子导致嗜酸性粒细胞的募集，白细胞介素-5（IL-5）促进嗜酸性粒细胞的增殖和分化。嗜酸性粒细胞的活化导致生物活性介质和氧自由基的释放，导致组织损伤，促进慢性炎症的发展。本研究分析出的3条通路参与哮喘的作用机制，其中hsa04660（T细胞受体信号）通路可能主要介导外源变应原的刺激导致T细胞增殖分化为Th2细胞，并刺激B细胞生成IgE。hsa04630（JAKSTAT信号）通路可能主要介导细胞因子的产生与靶基因表达。hsa04664（Fc-epsilon-RI信号）通路主要介导肥大细胞的激活与释放炎性因子，炎性因子作用于支气管从而导致支气管痉挛、肿胀和气道阻塞。参与这3条通路的基因主要有IL-4、RAF1、RELA、FOS、JUN、MAPK1、MAPK8、MAPK9、MAPK14、MAPK3和MAPK5。

白细胞介素-4（IL-4）是趋化因子家族的一种细胞因子，其是Ⅱ型辅助T细胞（Th2细胞）分泌的细胞因子，生物作用包括刺激活化B细胞和T细胞增殖、CD4+T细胞分化成Th2细胞。它也在调节体液免疫和适应性免疫中起关键作用。IL-4诱导B细胞抗体类别转换向IgE，上调第二型主要组织兼容性复合体的产生[20]。RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAF1）Ras-GTPase起分子开关的作用，在活性GTP-和非活性GDP-结合态之间交替。Ras蛋白通常位于质膜附近，被细胞外刺激激活后，与下游效应器相互作用，调节多种生物过程的信号通路，特别是细胞生长、存活和分化。经典的Ras信号途径始于表皮生长因子受体酪氨酸激酶激活Ras。激活的Ras启动一条信号转导途径，最后激活MAP激酶ERK1，ERK1转运到细胞核诱导基因表达[21]。

药物-成分-靶点-疾病网络显示槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、β-谷甾醇等成分可能是寒喘祖帕颗粒治疗哮喘的潜在物质基础。研究发现，槲皮素具有抗病毒、抗炎和免疫调节等药理作用[22]，可能参与基于IL-6、IL-1β调控的NF-κB信号通路（hsa04064）对支气管炎起到治疗作用[23]。山柰酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗糖尿病、抗骨关节炎和免疫调节等多种药理活性[24]。木犀草素和柚皮素具有抗病毒、抗炎等作用[25-26]。

维吾尔医认为处方中的小茴香、芹菜子为主药，具有温肺化痰、清除寒性乃孜来的作用；神香草可清除异常黏液质，促进机体自然随和，止咳化痰，平喘利肺；玫瑰花、芸香草散寒渗湿，止咳平喘，顺气通便平喘；荨麻子、铁线蕨、葫芦巴消散寒气，活血解痉，松化黏性体液，治疗气喘咳嗽顽痰，而甘草浸膏能减轻对咽部黏膜的刺激，并有缓解胃肠平滑肌痉挛与去氧皮质酮样作用，并使诸药协调有序，既能使邪气外达，又能断其痰瘀之源，阻断病情进展而奏效，使风寒可散，痰湿可化，瘀滞得行之效，清除气道局部的异常黏液质与黑胆质，消除“亚路克”，故感冒、咳嗽、哮喘之疾可平。中医认为处方中小茴香散寒止痛，理气和胃；胡芦巴温肾助阳，祛寒止痛；玫瑰花行气解郁，和血之痛；芹菜子消除寒湿痹阻，调和百药；神香草止咳化痰，平喘利肺。铁线蕨止咳化痰，荨麻子消散寒气，芸香草散寒渗湿，止咳平喘，行气宽中。全方共奏温中驱寒、疏散风寒、宣肺止咳之功。芹菜子挥发油可有效逆转肝纤维化[27]，治疗局部缺血的脑血管疾病，还能改善微循环，抑制细胞凋亡和降低氧化性应激[28-29]。小茴香挥发油具有抗炎镇痛、抗病毒、抗菌、抗肝纤维化作用，可抑制TGF-β/smad信号转导通路从而减轻肝硬化[30-31]。神香草挥发油部分具有止咳平喘、解痉等抗哮喘样药理活性。其总黄酮可通过抗炎、止咳、平喘作用来降低大鼠血清IgE，改善大鼠肺组织病理改变，减轻气道炎症[32]。其水提物表现出较明显的镇咳、祛痰和平喘的药理学活性[33]。

本研究将进一步对寒喘祖帕颗粒组方药进行拆解，探究寒喘祖帕颗粒治疗哮喘的主要组方成分，为临床研究提供基础。