水产饲料中真菌产毒关键环境因素及毒素种类的研究

李晓娜 田慧勇 杨晓夏 陈明山 曹涛 李森

摘要：为探明水产饲料中真菌产毒的关键因素和毒素种类，采用真菌菌种接种不同水产饲料培养基在不同温度、湿度、光照条件下，观察其生长、产毒情况。结果表明：从不同环境因素下南美白对虾饲料中真菌毒素的产生情况可以看出，在实验环境条件下有五种毒素检出，分别为玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A。该试验中15天时4种不同水产饲料中黄曲霉毒素B1的含量与饲料中赖氨酸含量关联度最大，其次为粗蛋白、粗灰分、粗纤维和水分。水产饲料中不同真菌毒素的发生条件不尽相同，饲料储存需根据当地季节及气候条件选择适当的储存条件来避免或尽可能降低真菌毒素带来的污染。

关键词：水产饲料;真菌毒素;环境影响;污染防控

中图分类号：S963        文献标识码：A

水产饲料业的成长基于水产养殖业的发展改革开放之后，上世纪80年代，以对虾、河鳗、甲鱼等为代表的名优水产品养殖迅猛发展引人注目，为了与我国水产养殖的发展进程相匹配，上世纪90年代，我国水产饲料产业逐步成型，水产饲料商品已成为我国饲料行业发展的亮点。2018年中国水产饲料产量达2211万吨，较2017年增加了131.2万吨，同比增长6.31%，但2019年起中国水产饲料产量开始下滑，2020年中国水产饲料产量为2123.6万吨，较2019年减少了79.3万吨，同比减少3.60%[1]。

到目前为止，广东省水产饲料中真菌毒素污染情况的报道非常少，由此以广东省的水产饲料霉变情况作为研究对象更加具有代表性。水产饲料被真菌毒素污染大致可分为两种情况，一是制造饲料的植物性原料被污染，二是成品饲料在储存过程中被真菌污染后产生毒素[2，3]。成品饲料霉变过程往往是内因与外因共同作用的结果[4，5]。当环境条件适合真菌活動时，饲料霉变会在短期内发生[6-8];当常规储藏条件下饲料本身因素适合真菌生长时，饲料霉变也会发生[9-10]。探明水产饲料中真菌产毒的关键因素将为真菌毒素在水产饲料中污染防控及进一步的研究提供理论依据。

1  实验材料及方法

1.1  菌种

本实验采用的菌种为购自广东省菌种保藏中心的木贼镰孢，编号：GIM3.506，其他编号：无;鲜绿青霉，编号：GIM3.505，其他编号：AS3.4517;寄生曲霉，编号：GIM3.395，其他编号：AS3.124;三线镰孢菌，编号：GIM3.491，其他编号：AS3.4731;实验室自分离菌株：黄曲霉;分离来源：霉变马友鱼干。

菌种的复苏与培养：用浸过70%酒精的脱脂棉擦净安瓿管，将冻干管尖端放在火焰上加热，滴少量无菌水至加热处使之破裂，用锉刀或镊子轻轻敲下安瓿管顶端，并将冻干管开口处在火焰上过1遍，并保持在火焰旁操作。用无菌吸管吸取0.2 mL无菌水，滴入管内，待安瓿管内的牛奶菌粉溶解呈悬浮状，再用无菌吸管吸取全部菌悬液接在2个马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板培养基上，并在28℃培养3～5天。观察PDA平板，使用接种针将单一的目标菌落接种至50 mL PDA肉汤中，在培养温度为28℃，转速为100 rpm的摇床培养8天。

1.2  试剂

甲醇：色谱纯;乙腈：色谱纯;超纯水由arium 611VF超纯水机制备;氯化钾、氯化钠、硫酸钾、正己烷、乙酸、氨水、乙醇均为分析纯试剂;马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），青岛海博公司。

1.3  实验器材

液相色谱质谱联用仪：TSQ Quantum Access，THERMO Fisher;电子分析天平：XS205，METTELER TOLEDO;可温控超声波提取器：HU-3120B，天津恒奥科技发展有限公司;旋涡混合器：VTX-3000L，vortex;漩涡震荡器：Multi Reax，Heidolph;旋转蒸发仪：Hei-VAP Value G3，Heidolph;离心机：上海安亭科学仪器厂;氨基酸自动分析仪：L-8900，HITACHI;冰箱：AQ-16L，先科;温湿度计：9014，得力;低温恒温培养箱：LTI-700W;LED随身灯。

1.4  不同环境因素对水产饲料中真菌产毒的影响

选择南美白对虾配合颗粒饲料作为实验饲料，将培养良好的菌株PDA肉汤接种至实验饲料中。分别设置不同环境条件，考察真菌产毒情况。

1.4.1  储藏湿度的选择

设置28℃条件下湿度为75%、84%、98%三个湿度区系，分别采用NaCl、KCl、K2SO4的饱和盐溶液来维持环境的相对湿度。12小时光照，12小时避光储藏。

1.4.2  储藏温度的选择

分别设置18℃、23℃、28℃三个温度区系，湿度为84%，12小时光照，12小时避光储藏。

1.4.3  储藏光照条件的选择

设置1天内光照时长分别为24小时、12小时、0小时，温度28℃，湿度84%储藏。

1.4.4  储藏时间的选择

分别于15天、30天、45天、60天、90天后将上述条件下储藏的饲料取样，按3.1方法检测其中目标毒素含量。

1.5  不同基质饲料中主要毒素种类

选择南美白对虾配合饲料、金鲳鱼配合饲料、鱼虾混合全效配合饲料、草虾配合饲料4种不同的水产配合饲料作为实验饲料，接种3.3.1.1菌种后在温度28℃，湿度84%条件下，12天光照，12天避光储藏90天，分别于15天、30天、45天、60天、90天取样，然后检测其中目标毒素含量。

饲料典型成分分析方法：饲料中水分含量的测定参照GB/T6435-2014《饲料中水分的测定》;粗灰分参照GB/T6437-2007《饲料中粗灰分的测定》;粗蛋白参照GB/T6432-1994《饲料中粗蛋白测定方法》;赖氨酸参照GB/T18246-2000《饲料中氨基酸的测定》中酸提取法;粗纤维参照GB/T6434-2006《饲料中粗纤维的含量测定过滤法》。

2  结果分析与讨论

2.1  不同环境因素对水产饲料中真菌产毒的影响

从不同环境因素下南美白对虾饲料中真菌毒素的产生情况（表1）可以看到，在实验环境条件下，在对目标毒素的检测中有5种毒素检出，分别为玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A。玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1及赭曲霉毒素A从第一次取样（储存15天）开始就检出阳性，并且含量较高，说明在设置的实验条件下，这三种毒素在短期内非常容易产生。T-2毒素和HT-2毒素则是在储存90天后才检出阳性，也就是说在设置的实验环境下这两种毒素的产生需要一定时间。赭曲霉毒素A在45天后的目标毒素检测中结果为阴性，可能的原因是储存过程中环境中其他微生物的作用将其降解或是产毒菌株在前期产生赭曲霉毒素A，后期产生或转化为赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C等其他次生代谢产物。玉米赤霉烯酮（图1）和黄曲霉毒素B1（图2）的发生规律有些相似，均是在30～60天达到峰值后开始下降，这并不符合预想的递增规律，可能原因是饲料在储存过程中当水分和热量在局部蓄积到一定程度，曲霉、青霉等适于中等水分和温度的真菌开始增多并产毒，但进一步储存过程中嗜热型、湿生性的细菌、放线菌、霉菌就开始大量繁殖，这些微生物共同作用使得不同菌种间有一定的竞争抑制作用。加上在后期可能出现能够降解真菌毒素的细菌或是产毒真菌被抑制后环境条件如光照等将产生的真菌毒素降解。但从饲料中菌落状况来看，霉变程度随着时间递增越来越严重，虽然实验条件下部分目标毒素有降低趋势，但并不代表饲料品质可逆，因为检测的目标毒素种类有限，微生物间作用机理复杂，目标毒素转化为其他有毒物质或产生其他有毒次生代谢产物也是极有可能的。

当湿度为84%，温度28℃，光照时长为12小时或24小时时，产生大量玉米赤霉烯酮所需时间最短，而当饲料储存30天后产量处于峰值时的环境因素中毒素产量最高的条件分别为湿度75%，温度23℃，光照时长12小时（图1）。黄曲霉毒素B1产量处于峰值时的环境因素中产量最高的条件为湿度98%，温度28℃，光照时长0小时（图2）。

选择玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1在45天，T-2毒素、HT-2毒素在90天，赭曲霉毒素A在30天时的产毒量进行灰色关联度分析（表2～表6）。其中玉米赤霉烯酮与温度条件关联度最大，黄曲霉毒素B1与湿度条件关联度最大，T-2毒素、HT-2毒素和赭曲霉毒素A与光照时长关联度最大。所以不同毒素在水产饲料中的产毒条件并不相同，即水产饲料在储存过程中应该根据当地气候选择适当的储存条件来避免饲料中真菌毒素的发生。

2.2  不同基质饲料中主要毒素种类

选择90天内水产饲料中各毒素含量较大时的值作为参考数列xa，饲料的典型性状作为比较数列xi（i=1，2，…，n）进行灰色关联度分析（表7）。在进行灰色关联度分析时，按公式（1）进行数据标准化处理，计算得到参考数列ya（k），比较数列yi（k）（k=1，2，…，m;i=1，2，…，n）。和S分别代表数列的均值和标准差。根据公式（2）求参考数列与比较数列的关联系数。其中ρ为分辨系数，一般取值为0.5，为ya（k）与yi（k）的差值绝对值的最小值，为ya（k）与yi（k）的差值绝对值的最大值，按公式（3）计算关联度，结果见表8。

从表7和表8可以看到，15天时4种不同水产饲料中黄曲霉毒素B1的含量与饲料中赖氨酸含量关联度最大，其次为粗蛋白、粗灰分、粗纤维和水分，这与75天时玉米赤霉烯酮含量与饲料典型性状间的关联次序一致。即在温湿度较高情况下一种饲料一旦被产毒真菌污染，就很可能同时被黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮污染。并且赖氨酸和蛋白含量高的饲料更容易被这两种毒素污染。与T-2毒素与HT-2毒素含量关联度最大的均为粗纤维含量，其次为水分含量。说明T-2毒素与HT-2毒素的發生规律与饲料中粗纤维和水分含量息息相关。而赭曲霉毒素A与饲料中粗灰分含量关联度最大。所以不同毒素在同一环境条件下与饲料中典型性状的相关性不尽相同，即不同饲料在储存过程中易感真菌毒素种类有差异，防治工作需要针对性的进行。

3  结论

水产饲料一旦被产毒真菌污染，在本实验设置环境条件下赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮及黄曲霉毒素B1会在短期内迅速发生，T-2毒素及HT-2毒素的发生则需要一定时间。赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮及黄曲霉毒素B1的产生在30～60天达到最大值，之后有所下降甚至消失，其原因可能为目标毒素被其他微生物或环境条件降解，也可能是产毒菌株自身作用转化为其他次生代谢产物。

水产饲料中不同真菌毒素的发生条件不尽相同，饲料储存需根据当地季节及气候条件选择适当的储存条件来避免或尽可能降低真菌毒素带来的污染。不同水产饲料易感真菌毒素种类有差异，但黄曲霉毒素B1与玉米赤霉烯酮发生规律相似，高含量赖氨酸及蛋白的饲料更易感染这两种真菌毒素。T-2毒素与HT-2毒素发生规律相似，粗纤维含量高的饲料易感染。赭曲霉毒素A则与饲料中粗灰分含量最相关。所以饲料在储存阶段真菌毒素的防治工作需有针对性的进行。

参考文献

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