重组鱼精蛋白的制备及抑菌活性分析

李招发 邱丹丹

（1. 华侨大学医学院，泉州 362021；2. 华侨大学生物医学学院，泉州 362021）

鱼精蛋白（protamine，Pro）是一种由30-50个氨基酸组成的多聚阳离子肽，以精氨酸为主，存在各类雄鱼成熟精巢组织与带负电的DNA紧密结合［1］。Pro抑菌作用具有广谱性、高效性和安全性。Pro对黄色葡萄球菌、酵母菌、霉菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及四链球菌均表现为抑制效果，可作为绿色防腐剂应用于食品工业中［2-4］。现在普遍认为鱼精蛋白抑菌活性是由其分子中存在着大量精氨酸，精氨酸中的正电荷胍基与细胞壁肽聚糖的负电荷产生静电作用，但它们均能与细胞膜特异性结合，通过破坏细胞膜结构，从而导致整个细胞不能正常运行［5］。在手术中，Pro作为肝素抗凝血剂用于因肝素注射过量而引起的出血；还可以延迟或阻止胰岛素的释放［6-7］。Pro与 DNA 有较强的结合能力，作为DNA药物载体而被广泛应用［8-9］。

细胞珠蛋白（cytoglobin，CYGB）是 Kawada等［10］在大鼠肝星状细胞中发现的一种六配位血红素球蛋白，分子量为21.4 kD。研究表明CYGB具有过氧化物酶活性和清除氧自由基的功能，并能通过调控CYGB基因的表达抑制肝纤维化［11］。本课题研究表明，CYGB在原核表达系统中表达量极大，可借助CYGB蛋白来实现目的蛋白的高效表达［12］。鱼精蛋白的主要来源是天然提取，产量受限，且鱼精蛋白富含精氨酸，这样编码的氨基酸序列在大肠杆菌中是难以表达的［13］，严重制约了其应用。本研究旨在通过基因工程技术，通过CYGB融合表达，探索大量制备重组鱼精蛋白的可行性。因后续纯化过程中需用CNBr切割CYGB-Pro中的甲硫氨酸位点，以裂解出重组 Pro（recombinant protamine，rPro）。将CYGB内部的甲硫氨酸对应的密码子ATG全部突变为异亮氨酸对应的密码子ATC（起始密码子除外）获得CYGBm。采用CYGB与Pro融合，并在原核表达系统表达。为重组抗菌肽的研究和开发提供了依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21（DE3）、pET22b、pET22b-CYGB均为本实验室保藏。pUC57-Pro为上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 试剂与材料 硫酸鱼精蛋白（Sigma公司）；NdeⅠ限制性内切酶、BamHⅠ限制性内切酶、BglⅡ限制性内切酶、EcoRⅠ限制性内切酶、Pyrobest DNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker（大连宝生物工程有限公司）；凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒（碧云天生物公司）；引物合成（表1）、DNA 测序（上海生工生物工程有限公司完成）；其他试剂均为国产分析纯。

表1 本研究涉及的寡核苷酸序列Table 1 Oligonucleotide sequences involved in this study

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pET22b-CYGBm 的构建与表达验证实验 以实验室保存的pET22b-CYGB质粒为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物，以SEQ ID NO.6为下游引物，PCR得片段1-6，以SEQ ID NO.7为上游引物，以SEQ ID NO.8为下游引物，PCR得片段7-8，核酸电泳后，回收片段1-6和7-8。以回收片段1-6和7-8为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物，以SEQ ID NO.8为下游，PCR得片段（1-8）67，核酸电泳后，回收片段（1-8）67。以回收片段（1-8）67模板，以SEQ ID NO.1为上游引物，以SEQ ID NO.4为下游引物，PCR得片段1-4，以SEQ ID NO.5为上游引物，以SEQ ID NO.8为下游引物，PCR得片段5-8，核酸电泳后，回收片段1-4和5-8。以回收得到的片段1-4和5-8为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物，以SEQ ID NO.8为下游引物，PCR得片段（1-8）45，核酸电泳后，回收片段（1-8）45。以回收片段（1-8）45模板，以SEQ ID NO.1为上游引物，以SEQ ID NO.2为下游引物，PCR得片段1-2，以SEQ ID NO.3为上游引物，以SEQ ID NO.8为下游引物，PCR得片段3-8，核酸电泳后，回收片段1-2和3-8。以回收片段1-2和3-8为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物，以SEQ ID NO.8为下游引物，PCR得片段（1-8）23，即CYGBm。CYGBm和pET22b用NdeI/EcoRI双酶切，核酸电泳后，回收目的片段，T4 DNA Ligase连接，构建pET22b-CYGBm（图1）。将质粒pET22b-CYGBm与BL21感受态混合，42℃热激转化，37℃ 100 μL/mL（Amp+）LB 平板（10 g/L tryptone，5 g/L yeast extarct，10 g/L NaCl） 培 养20 h，挑选单克隆菌落（上海生工生物工程有限公司DNA 测序结果正确），接入乳糖诱导培养基（15 g/L tryptone，12 g/L yeast extarct，3 g/L NaH2PO4·2H2O，7 g/L K2HPO4·3H2O，2.5 g/L NaCl，0.2%葡萄糖，2.1 mmol/L乳糖，0.05% MgSO4·7H2O）中，37℃诱导培养30 h，收集菌体，SDS-PAGE电泳检测CYGBm在原核表达系统情况。

图1 重叠延伸PCR定点突变CYGB流程图Fig. 1 Flow chart of fixed point mutations CYGB by overlapping extended PCR

1.2.2 工程菌BL21-pET22b-CYGBm-Pro的构建与表达实验 pUC57-Pro质粒（上海生工生物工程有限公司合成）和pET22b-CYGBm质粒经NdeI/EcoRI双酶切，核酸电泳后，回收目的片段，通过T4 DNA Ligase将pET22-CYGBm与Pro连接，构建pET22-CYGBm-Pro。将pET22b-CYGBm-Pro与BL21感受态混合，42℃热激转化，37℃ 100 μL/mL（Amp+）LB平板培养20 h，挑选单克隆菌落经PCR法和双酶切法验证，阳性克隆子命名为工程菌BL21-pET22b-CYGBm-Pro。工程菌BL21-pET22b-CYGBm-Pro接入乳糖诱导培养基中，37℃诱导培养30 h，乳糖诱导菌液于4℃，10 000 r/min离心20 min，收集菌体存在-80℃备用。

1.2.3 rPro 的纯化实验 将上述收集的菌体称重，经-80℃和4℃反复冻融3、4次，以1∶10的比例加入包涵体破菌液（1.22 g Tris-HCl、5.85 g NaCl、0.075 g EDTA、3.3 mL 30%曲拉通 X100，加入 150 mL 超纯水溶解，调 pH 至 8.0，定容至 200 mL），冰中悬浮菌体，冰浴超声，功率200 W，5 s超声，5 s间歇，4℃，10 000 r/min离心20 min，弃上清，收集包涵体沉淀。按3倍体积量加入包涵体洗涤液（3.1 g Tris-HCl、14.63 g NaCl、0.186 g EDTA、8.3 mL 30%曲拉通 X100、60.2 g 尿素，加入 400 mL 超纯水溶解，调 pH 至 8.0，定容至 500 mL），重悬沉淀，冰中摇动洗涤10 min，4℃，10 000 r/min，离心20 min。如此重复3、4次。加入适当包涵体溶解液（3.1 g Tris-HCl、14.63 g NaCl、0.186 g EDTA、242.5 g 尿素，加入 400 mL 超纯水溶解，调 pH 至 8.0，定容至 500 mL），重悬沉淀，冰浴平缓摇动1 h后4℃冰箱放置过夜以充分溶解，10 000 r/min，离心20 min，收集上清。上清液经20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液平衡的Sephadex G-25凝胶过滤，CYGBm-Pro复性，并初步除去小分子杂质。Sephadex G-25凝胶过滤接收液再经肝素琼脂糖凝胶层析柱纯化、CM阳离子琼脂糖凝胶层析柱分离纯化，获得重组CYGBm-Pro融合蛋白。纯化后的重组融合蛋白CYGBm-Pro经0.2 mmol/L浓盐酸和50 mg/mL CNBr避光室温裂解24 h，经20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液平衡的Sephadex G-25凝胶过滤，即得纯化的rPro。

1.2.4 rPro的抑菌活性分析实验 利用试管培养法分析rPro对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及巴斯德毕赤酵母GS115 的抑菌活性。取活化菌液10 μL接种于5 mL 培养基中培养6 h 后，用紫外分光光度计测定OD600值，分析测试菌加rPro（168.96 μg/mL、84.48 μg/mL、42.24 μg/mL、21.12 μg/mL）和阴性对照（去离子水）的生长曲线，计算抑制率（inhibition rate）＝（阴性对照OD600-加rPro OD600）/阴性对照OD600，从而检测分析抑菌活性。

1.2.5 rPro在鱼虾储存中的应用实验 称取经21.12 μg/mL rPro浸润处理、未处理的虾尾5 g，用干净剪刀将其剪烂细碎，放入放入盛有50 mL三角瓶，加入50 mL去离子水，搅匀不时振荡，浸渍30 min后过滤，留取滤液冰箱4℃储存备用，储存时间不宜过久。将盛有10 mL 2%硼酸溶液的烧杯中加入5滴指示液置于冷凝管下端，并将冷凝管下端插入到烧杯吸收液液面以下。吸取样品滤液于蒸馏瓶内，加入5 mL 1%氧化镁，迅速加上塞子，密闭封紧，并在冷静管外端包上棉花，加热蒸馏30 min停止蒸馏，吸收液用0.01 mol/L盐酸标准溶液滴定，待终点为蓝紫色停止滴定。记录好盐酸标准溶液用量。同时做无rPro的空白对照实验和以Sigma公司购买的天然提取的硫酸鱼精蛋白（Pro）阳性对照实验。根据盐酸标准溶液的用量计算的挥发性盐基氮的含量（TVB-N）。称取经21.12 μg/mL rPro浸润处理、未处理的虾尾5 g，将其剪碎放入研钵，将样品研成肉泥，加入50 mL蒸馏水，充分搅拌后过滤取滤液。同时做无rPro的空白对照实验和以Sigma公司购买的天然提取的硫酸鱼精蛋白（Pro）阳性对照实验。测量其pH。

2 结果

2.1 pET22b-CYGBm的构建与CYGBm的表达

如图1所示，经过3次重叠延伸PCR定点突变，将CYGB基因内部的甲硫氨酸对应的密码子ATG全部突变为异亮氨酸对应的密码子ATC（起始密码子除外）获得CYGBm。将质粒pET22b-CYGBm转化BL21感受态，挑选单克隆菌落乳糖诱导表达，经SDS-PAGE 检测。结果表明，突变后的CYGBm其表达量与CYGB一样仍可在原核表达系统中高表达（图 2）。

2.2 pET22b-CYGBm-Pro的构建、表达与rPro纯化

CYGBm基 因 为 570 bp，Pro基 因 为 99 bp，CYGBm-Pro基因理论长度约为669 bp。如图3结果所示，阳性单克隆菌落PCR产物核酸电泳条带和pET22b-CYGBm-Pro质粒双酶切产物核酸电泳条带与法与其基因理论长度相吻合。将质粒pET22b-CYGBm-Pro转化BL21感受态，挑选单克隆菌落乳糖诱导表达，经SDS-PAGE 检测。结果表明，乳糖诱导后在全菌和菌体裂解液离心沉淀中，在26 kD左右有明显的条带，说明CYGBm-Pro融合蛋白在原核表达系统以包涵体形式高表达（图4）。经BandScan软件对图4蛋白电泳泳道2进行灰度分析融合蛋白CYGBm-Pro表达率超过10%。CYGBm-Pro包涵体经离心、洗涤、变性、Sephadex G-25凝胶复性、肝素琼脂糖凝胶层析柱纯化、CM阳离子琼脂糖凝胶层析柱分离纯化（图4，5：纯化的CYGBPro）。融合蛋白CYGBm-Pro纯化收率为25%。纯化的CYGB-Pro CNBr裂解（裂解率为75%）、Sephadex G-25凝胶过滤，即得纯化的rPro（图4，6：纯化的rPro）。目的蛋白rPro总收率为17.5%，总收率偏低，主要原因在于融合蛋白CYGBm-Pro是以包涵体形式表达，包涵体的复性一般都很低。

图3 重组质粒pET22b-CYGBm-Pro PCR法和双酶切法核酸电泳图Fig. 3 Nucleic acid electrophoresis of recombinant plasmid pET22 B-CYGBm-Pro by PCR and double enzyme digestions

图4 CYGBm-Pro表达以及纯化的CYGBm-Pro和rPro的SDS-PAGE图Fig. 4 SDS-PAGE of CYGBm-Pro expression and purified CYGBm-Pro and rPro

2.3 rPro对细菌生长抑制作用

如图5所示，rPro对普通的大肠杆菌、耐药的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、真核生物毕赤酵母GS115均有明显的抑菌活性，且纯化的rPro浓度越高，抑菌活性越强，从而证明了通过基因工程技术获得的rPro具有抑菌活性。

图5 不同浓度rPro对不同细菌生长抑制率曲线图Fig. 5 Curves of growth inhibition rates of different bacteria with different concentrations of rPro

2.4 rPro对鲜虾的保鲜应用效果

鲜虾储存过程中会发现腐变，腐变程度可通过pH、TVB-N监测，一般鲜虾pH＞7、TVB-N＞20 mg/100，不可食用。每24 h测经rPro处理、天然Pro处理和未处理的pH、TVB-N。结果表明：rPro处理样品比未经处理样品在4℃储存时间更长，其效果与天然Pro处理样品几乎相当，具有一定的保鲜效果（图6）。

图6 rPro处理虾储存期间pH值（A）和TVB-N值（B）变化曲线图Fig. 6 Curves of pH values（A）and TVB-N values（B）of shrimp treated by rPro during storage

3 讨论

目前国内外主要通过天然提取制备鱼精蛋白［14-15］。虽然鱼精蛋白已从多种鱼类及其它水生动物中提取得到，但产量十分有限。精蛋白富含精氨酸，而且大多是由AGA或AGG这两个大肠杆菌稀有密码子编码的；另外，精蛋白具有较为广谱的抗菌能力，在菌体外加入精蛋白，会导致细菌细胞壁裂解，使细菌死亡。因此，精蛋白在大肠杆菌中是难以直接表达的［3，13］。目前精蛋白在大肠杆菌中主要是以融合蛋白形式表达。王静等［16］利用牛β-防御素LAP 和牛CATHL2 抗菌肽融合成功的高表达抗菌肽，张雅丽等［13］在大肠杆菌中融合表达牛精蛋白，王昊等［17］在大肠杆菌中融合表达抗恶性黑素瘤单链抗体-鱼精蛋白，孟艳玲等［18］在大肠杆菌中融合表达人抗HBsAg单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋自。本研究采用基因工程方法制备鱼精蛋白，选取鲑鱼鱼精蛋白，依据大肠杆菌密码子偏好性，优化并合成了Pro基因序列。不同物种的基因在密码子使用上存在着明显的偏爱性，密码子偏爱性对重组蛋白质的异源表达具有重要影响。从生物学基础来看，不同的密码子使用密码子模式不同的形成可能与基因的GC含量有关。在生物中高表达的基因密码子的使用偏性一般比较大。这些偏好可能与两个原因有关：一是避免使用类似终止密码子的密码子；二是这些偏好能够有效地翻译密码子，因为这些密码子对应于生物体中非常丰富的tRNA［19-20］。采用PCR定点突变的技术，将CYGB中甲硫氨酸位点ATG（除起始密码子）全部突变为ATC，成功获得CYGBm。CYGBm 融合成功的高表达了CYGBm-Pro。研究发现CYGBm-Pro融合蛋白以包涵体形式大量表达。经Sephadex G-25凝胶复性、肝素亲和层析和阳离子交换层析，获得了纯度较高的CYGBm-Pro。CYGBm-Pro经CNBr 裂解及进一步纯化后得纯化的rPro。通过试管培养法对所得rPro蛋白抗菌活性进行分析，发现对所选的革兰氏阴性菌大肠杆菌、革兰氏阳性枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌以及真核生物巴斯德毕赤酵母 GS115 均有显著的抗菌活性，对鲜虾有明显的保鲜作用。

4 结论

本研究利用无甲硫氨酸位点（除起始密码子）的 CYGBm与鱼精蛋白融合成功的制备了有明显抗菌活性的重组鱼精蛋白。不仅有较高的表达量，更有利于CYGBm-Pro的CNBr裂解，提高rPro总的收率，为工业化生产重组鱼精蛋白提供了一条新思路。