Microbacterium sp. BD6在Cr（VI）污染农田土壤修复中的应用研究

杨宗政 赵晓宇 刘丹 许文帅 吴志国

（1. 天津科技大学化工与材料学院，天津 300457；2. 天津科技大学海洋与环境学院，天津 300457；3. 天津市卤水化工与资源生态化利用重点实验室，天津 300457）

铬被广泛应用于金属电镀、冶金、铬酸盐制造、印染等行业［1-2］，当工业生产中各类废水流入土壤，就会造成严重的土壤铬污染问题，尤其是Cr（VI）污染。Cr（VI）的毒性对土壤中的动植物以及微生物都会产生严重的影响［3-4］。土壤中的Cr（VI）不仅会造成植物减产，还会在植物中发生生物积累后进入食物链，进而影响动物及人类的健康。因此，对Cr（VI）污染农田进行安全且有效地修复已成为亟待解决的难题［5］。

在众多土壤修复方法中，微生物修复具有经济环保等优势，是重要的土壤修复手段之一。Srivastava等［6］通过实验证明，Cr（VI）胁迫会对植物系统造成破坏，堆肥及黑曲霉的共同作用可去除土壤中Cr（VI）污染，从而显著改善小麦植株的生长情况。陈土凤等［7］利用Exiguobacterium sp.对土壤中的Cr（VI）进行还原，小白菜的生长情况及受到的氧化应激情况明显改善。可见，通过微生物修复Cr（VI）污染土壤，可缓解其对植物的毒性及氧化胁迫，并减少植株对Cr（VI）的吸收，对植物无公害化具有重大意义。微生物群落特征是表征土壤质量变化的最敏感及最具潜力的指标之一。土壤中的微生物多样性及群落结构会在受到重金属胁迫后发生变化，因此，通过微生物多样性的变化反映土壤污染程度被广泛采用［8-10］。

由于土壤环境复杂，对微生物适应能力要求较高，因此，利用微生物修复Cr（VI）污染土壤还大多处于研究阶段。本研究尝试将课题组前期分离筛选的具有较好Cr（VI）还原特性的菌株Microbacterium sp. BD6［11］用于 Cr（VI）污染土壤修复中，对菌株BD6去除土壤中Cr（VI）的影响因素进行了研究，并通过盆栽实验及土壤微生物群落分析等试验对Cr（VI）的毒性及菌株BD6对Cr（VI）污染土壤的修复效果进行表征，以期为实际修复Cr（VI）污染农田土壤提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 菌株是本课题组分离自福建省厦门市某电镀厂下水道的淤泥，菌株BD6 的16S rRNA 部分基因序列保存于GenBank，登陆号为MK611086。

1.1.2 培养基 LB培养基：蛋白胨 10.0 g/L，酵母浸粉 5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0；在LB液体培养基中加入琼脂 2 g/100 mL 即成LB固体培养基。所有培养基121℃ 高压湿热灭菌 20 min 后使用。含Cr（VI）培养基是根据所需Cr（VI）浓度向LB培养基中添加相应量的Cr（VI）标准溶液［11］。

1.1.3 供试土壤来源 供试农田土取自河南省安阳市黄县某农田（北纬 35°95′，东经 114°86′）。土壤有机质含量为9.63 g/kg，pH值为7.2，全氮0.31 g/kg，总磷11.61 mg/kg，未检测到Cr（VI）。土壤经自然风干后，过孔径为2 mm的筛网，含水率为6.1%。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备 挑取划线纯化后的BD6菌株单菌落接入LB培养基中，于180 r/min、30℃的恒温摇床培养24 h后，离心后重悬于无菌水中制得浓度为3×108CFU/mL 的菌悬液备用。

1.2.2 配制Cr（VI）标准溶液 配制5 g/L Cr（VI）的标准溶液：将重铬酸钾在 120℃ 烘干 2 h，称取14.1446 g 溶于1 L去离子水中，过 0.22 μm 滤膜以除菌，置于4℃冰箱中备用。

1.2.3 土壤中Cr（VI）含量测定 消解按照《危险废物鉴定标准 浸出毒性鉴别》（GB 5085.3-2007）中《附录D 固体废物 六价铬分析的样品前处理 碱消解法》的方法进行。Cr（VI）测定按照文献［12］进行。

1.2.4 Cr（VI）还原率计算方法：

式中，η：Cr（VI）还原率%；C0：土壤中Cr（VI）初始浓度，mg/kg；C1：Cr（VI）还原后，按照1.2.3步骤测定得到的土壤中Cr（VI）浓度，mg/kg。

1.2.5 土壤条件对菌株BD6还原Cr（VI）的影响

1.2.5.1 土壤含水率的影响 按16%的接种量（16 mL菌液/100 g土，将菌液于土壤表面多点投加后进行搅拌使其与土样充分混合，下同）向Cr（VI）浓度为100 mg/kg的土壤（100 mg Cr（VI）/ kg含水率6.1%的自然风干土，下同）中接种制备的菌液，向土壤中补充去离子水使土壤含水率分别为25%、30%、40%和50%，每组设置3平行，将样品置于30℃培养箱培养，定时测定其中Cr（VI）含量，考察土壤含水率对修复Cr（VI）污染土壤的影响。

1.2.5.2 温度的影响 同1.2.5.1步骤和接种量接种菌液，设置土壤含水率为30%，将土样分别置于15、20、25、30、35和40℃培养箱中培养，每组设置3个平行，定时测定土壤中Cr（VI）含量，考察温度对修复Cr（VI）污染土壤的影响。

1.2.5.3 老化时间的影响 同1.2.5.1步骤和接种量接种菌液，其中Cr（VI）老化土壤时间分别为新鲜制备土壤（0 h）、老化20 d土壤、老化60 d土壤，设置土壤含水率为30%，将土样置于30℃培养箱中培养，每组设置3个平行，定时测定土壤中Cr（VI）含量，考察Cr（VI）老化土壤时间对修复Cr（VI）污染土壤的影响。

1.2.5.4 其它重金属离子的影响 向含 Cr（VI）100 mg/kg 的土壤中分别投加氯化铜、氯化锌、氯化锰、氯化镉、氯化镍配制的溶液，使Cu2+、Zn2+、Mn2+、Cd2+、Ni2+在土壤中的浓度分别达到 50 mg/kg土。同1.2.5.1步骤和接种量接种菌液，以只含 Cr（VI）100 mg/kg 的土壤作为对照，设置土壤含水率为30%，将土样置于30℃培养箱中培养，每组设置 3个平行，定时测定土壤中Cr（VI）含量，考察重金属离子对修复Cr（VI）污染土壤的影响。

1.2.5.5 接种量的影响 将制备的菌液分别按6%、12%、16%和26%的接种量向Cr（VI）浓度为100 mg/kg的土壤中接种，设置土壤含水率为30%，将土样置于30℃培养箱中培养，每组设置3个平行，定时测定土壤中Cr（VI）含量，考察接种量对修复Cr（VI）污染土壤的影响。

1.2.5.6 Cr（VI）初始浓度的影响 同1.2.5.1向Cr（VI）浓度分别为50、100、150和300 mg/kg土壤中接种菌株BD6，设置土壤含水率为30%，将土样置于30℃培养箱中培养，每组设置3个平行，定时测定Cr（VI）含量，考察Cr（VI）初始浓度对修复Cr（VI）污染土壤的影响。

1.2.6 电子供体的选择以及菌株还原能力的测定 向 Cr（VI）浓度为100 mg/kg 的土壤中分别投加果糖、乳糖、葡萄糖、丙三醇和丙酮酸钠（20 g电子供体/kg土）。将菌液同1.2.5.1步骤和接种量接种于以上土壤中，以不投加电子供体的Cr（VI）浓度为100 mg/kg 的土壤作为对照，设置土壤含水率为30%，将土样置于30℃培养箱中培养，每组设置3个平行，定时测定土壤中Cr（VI）含量，考察不同电子供体对修复Cr（VI）污染土壤的影响。

1.2.7 盆栽实验 按照1.2.5.1步骤和接种量向含Cr（VI）100 mg/kg土壤中接种菌株BD6，设置土壤含水率为30%，置于30℃培养箱恒温培养。将处理96 h的土壤含水率调节为20%，与Cr（VI）含量分别为 0、5、10、20、30、50、80和 100 mg/kg土 壤，含水率为20%的土壤一起进行盆栽实验。挑选颗粒饱满、形状、质量、大小均匀的黄豆播种于花盆中。每盆装土30 g（含水率20%），播种2粒黄豆，每个土样6盆平行，定时浇水，25 d 后收获。观察植株生长形态，计算种子发芽率方法同文献［13］，测定植株鲜重方法同文献［14］，株高及植株内总铬含量测定方法同文献［15］。

1.2.8 土壤微生物群落分析

1.2.8.1 土壤取样及方法 取原土、100 mg/kg C（rVI）老化12 h土壤、菌株BD6修复100 mg/kg Cr（VI）污染土壤的修复组土壤及投加20 g丙三醇/kg土壤的菌株BD6修复100 mg/kg Cr（VI）污染土壤的修复组土壤（修复组土壤取修复时间为96 h、10 d、15 d的土壤）进行高通量测序。取样方法：（1）去除土壤表面覆盖物。（2）用酒精棉擦拭采样器，待酒精挥发完全后，使用采样样方处土壤浸润采样器。后续每次更换样方均需重复此步骤。（3）采用梅花型五点取样法进行混合取样。（4）将混合好的土壤样本分装多份，每份5-10 g，置于-80℃冰箱保存，用于高通量测序。

1.2.8.2 高通量测序及数据分析 以土壤样本DNA为模板，采用包含“CTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC” 序列的下游引物扩增原核生物16S rDNA的V3和V4高变区，进行Illumina MiSeq测序。经过质量过滤，去除嵌合体序列，最终得到的序列进行OTU聚类（序列相似性设为97%）。然后对OTU的代表性序列进行物种分类学分析，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。基于OTU得到分析结果，采用对样本序列进行随机抽平的方法，分别计算Ace、Chao1、Simpson、Shannon等α多样性指数，反映群落的物种丰度和多样性。通过RDP分类鉴定OUT代表性序列的微生物分类相对丰度。

1.2.9 菌株BD6在土壤中的定殖情况

1.2.9.1 土壤取样及方法 取修复时间为0 h、96 h、10 d及15 d的含100 mg/kg C（rVI）的修复组土壤（与高通量测序土样修复组取自同一处），采用荧光定量PCR法，考察菌株BD6在土壤中的定殖情况。取样方法同1.2.8.1。

1.2.9.2 荧光定量PCR 以提取的土壤样品的总DNA为模板，扩增的目标基因为菌株BD6的16S rRNA基因部分序列。所使用的引物为16S-F（5′-AAGTGACGGTACCTGCAGAA-3′）及 16S-R（5′-GTTGAGCCTCGGGATTTCAC-3′）。于 ABI 7900 Real-time PCR system（Applied Biosystems）扩增仪上进行绝对定量PCR 分析。每个样品设3次重复，并设不加模板的反应管为阴性对照。反应体系为20 μL：ddH2O 12.8 μL，10×Buffer 2 μL，Template 3 μL，正反 向 引 物 各 0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，DMSO 0.5 μL，TransStart Taq Polymerase 0.2 μL。反应程序为 ：95℃5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30 个循环；72℃ 5 min。稀释相应的质粒浓度从10-1到10-8，并绘制标准曲线。

1.2.10 数据处理与统计分析 数据采用Microsoft Excel 2019和SPSS 23.0 软件对相关数据进行处理和差异显著性分析。

2 结果

2.1 不同条件对菌株BD6还原Cr（VI）的影响

不同土壤条件对菌株BD6还原Cr（VI）的影响如图1所示。菌株BD6对土壤中Cr（VI）的还原率随着含水率的升高而增加，当含水率达到30%及以上，菌株BD6对Cr（VI）还原效果较好。菌株BD6在不同温度下对Cr（VI）的还原实验中，96 h时菌株BD6在25-40℃范围内对土壤中Cr（VI）的还原率均可达到90%以上，且去除效率随着温度的升高而提升，当温度低于25℃，菌株BD6对土壤中Cr（VI）的还原率则明显降低。Cr（VI）老化土壤时间对菌株BD6还原土壤中Cr（VI）的影响并不显著，如图1所示，菌株BD6对新制Cr（VI）污染土壤及Cr（VI）老化20 d、60 d的土壤的Cr（VI）还原率分别为90.8%、92.7%和91.5%。菌株BD6在分别含 50 mg/kg 土 的 Zn2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Cd2+的 土壤中均可以对Cr（VI）进行还原，但是还原效率会受到不同程度的抑制。与对照组相比，Cu2+、Cd2+、Ni2+较明显抑制了还原效果，Zn2+的抑制作用较轻，Mn2+影响最小。接种量对菌株BD6还原土壤中Cr（VI）的影响如图1所示，随着接种量增加，BD6对土壤中Cr（VI）还原率提高。综合考虑修复效果及经济成本，选择16 mL菌液/100 g土为最佳接种量。Cr（VI）初始浓度对菌株BD6还原Cr（VI）的影响如图1所示，菌株BD6在48 h内即可对初始浓度为50 mg/kg的土壤中Cr（VI）还原90%以上。96 h，菌株BD6可对初始浓度为100 mg/kg土壤中Cr（VI）还原90%以上。菌株BD6对Cr（VI）的96 h去除率随着Cr（VI）初始浓度增加而降低。菌株BD6对土壤中浓度为100 mg/kg及以下的Cr（VI）有着较好还原效果。

图1 不同条件对菌株BD6还原Cr（VI）的影响Fig.1 Effects of factors on the Cr（VI）reduction by strain BD6

2.2 不同电子供体对土壤修复的影响

添加电子供体能加快菌株BD6在液体培养基中还原Cr（VI）的速率，因此本研究对土壤修复中电子供体利用情况也进行了测试。如图2所示，投加果糖、乳糖、葡萄糖、丙三醇、丙酮酸钠等均会对菌株BD6还原土壤中Cr（VI）有促进作用。其中添加丙酮酸钠作为电子供体的促进效果最好，36 h对Cr（VI）的还原率即可达到90%；其次为添加丙三醇作为电子供体，48 h对 Cr（VI）的还原率可达到90%。综合考虑经济和实际使用因素，本研究依然使用丙三醇作为土壤修复中的外加电子供体。

图2 不同电子供体对菌株BD6还原土壤中Cr（VI）的影响Fig.2 Effect of different electron donors on Cr（VI）reduction in soil by strain BD6

2.3 Cr（VI）污染土壤修复前后对植株的影响

含不同浓度Cr（VI）土壤中种植大豆25 d后大豆植株的生长情况，从图3可以看出，对照组大豆生长良好，株高较高，根部较为发达。随着Cr（VI）浓度增大，植株高度、根系发达程度及发芽率明显受到越来越严重的抑制，叶茎发黄且叶片稀少，当Cr（VI）浓度达到100 mg/kg时大豆在土壤中发芽率也受到较大影响，而Cr（VI）浓度为100 mg/kg土壤经菌株BD6修复的处理组中生长的大豆植株则生长情况良好。

图3 大豆盆栽实验Fig.3 Soybean pot experiments

表1数据反映了植株各项生长指标受土壤中Cr（VI）的影响。虽然当Cr（VI）浓度达到100 mg/kg时，才会对发芽率产生一定影响，但较低Cr（VI）浓度已经会对植株生长产生抑制作用，Cr（VI）含量分别为5、10、20、30、50、80和100 mg/kg的土壤中生长的大豆植株相较于不含Cr（VI）的土壤中生长的大豆植株，植株高度和重量随Cr（VI）浓度升高而逐渐降低。本研究还对植株体内吸收的铬含量进行了测定，随着土壤中Cr（VI）浓度增大，植株内的铬含量也显著增加。未经处理的含Cr（VI）100 mg/kg土壤中生长的大豆植株体内铬含量为5 mg/kg，含Cr（VI）100 mg/kg的土壤经BD6处理后，植株中并未检出铬。以上结果表明，Cr（VI）对大豆植株生长会产生明显的毒性作用，菌株BD6对土壤的修复极大缓解了Cr（VI）对大豆植株的植物毒性，也降低了植株对铬的吸收。

表1 植株各项生长指标Table 1 Growth indicators of plants

2.4 Cr（VI）污染土壤修复对土壤微生物群落的影响

2.4.1 菌株BD6修复Cr（VI）污染土壤对微生物群落影响 通过16S rRNA基因V3+V4区域高通量测序分析土壤样品，能够反映样品中细菌群落的种类和结构的变化。空白土壤（Y）、含Cr（VI）100 mg/kg土壤（Cr）、菌株 BD6修复含 Cr（VI）100 mg/kg 96 h土壤（未加丙三醇A-96 h，添加丙三醇G-96 h）、修复10 d土壤（未加丙三醇A-10 d，添加丙三醇G-10 d）、修复15 d土壤（未加丙三醇A-15 d，添加丙三醇G-15 d）等样品的微生物α多样性如表2所示。在所有多样性指数中，Ace与Chao1指数反映出无Cr对照组微生物丰度最高，含Cr组较低，在投加菌株BD6修复后微生物丰度指数普遍呈增大趋势；Shannon和Simpson指数反映了微生物群落的多样性，多样性96 h时降到最低，而后又呈增大趋势，且外加丙三醇组在微生物丰度和多样性方面在同等条件下略大于未添加组或基本持平。表2中数据反映出Cr（VI）对微生物的毒性作用使土壤中微生物多样性显著降低，随着菌株BD6对Cr（VI）污染土壤修复的时间增加，微生物丰度和多样性相对于污染土壤有了显著恢复。

表2 α多样性指数Table 2 α diversity index

在土壤微生物群落结构方面，如图4-A所示为门水平的物种分布柱状图，在菌株BD6修复Cr（VI）96 h后，优势菌门为Actinobacteria（放线菌门），次优势菌门为Firmicutes（厚壁菌门），与原土微生物群落结构显著不同，当修复时间达到10 d，已将Cr（VI）从土壤中基本去除的情况下，土壤中优势菌门为Proteobacteria（变形菌门），次优势菌门为Firmicutes（厚壁菌门），与原土优势菌门相同。

在门水平上，优势菌一直是Proteobacteria，Firmicutes和Actinobacteria，但是相对丰度则是有较大变化；对比是否添加丙三醇，微生物群落结构在10 d时有着较大差异。对比Y和Cr样品，虽然门水平看不出显著差异，但从属水平的菌落结构来看Ramlibacter相对丰度迅速上升，该菌属也是在重金属环境下报道较多的一个优势种属。在修复组中，随着Microbacterium sp. BD6的加入，土壤微生物群落结构会发生较大变化，从图4-B中可以看到随着修复时间延长，菌属Microbacterium的相对丰度是不断下降的。

2.4.2 菌株BD6在Cr（VI）污染土壤修复中的定殖 通过对菌株BD6在土壤中的qPCR检测显示，在最初48 h内 BD6在土壤中的数量会急剧减少，之后一直处于持续下降状态，到15 d时，降低为最初接种量的3%以下，说明菌株BD6在土壤中并不会成为优势菌。这与属水平的微生物群落结构（图4-B）中显示的微杆菌属在群落中相对丰度持续下降的情况一致。

图4 土壤微生物群落结构组成Fig.4 Structure composition of soil microbial community

3 讨论

Cr（VI）污染土壤的生物修复具有经济且环境友好等优势，多种微生物已被报道用于土壤Cr（VI）修复，如硫酸盐还原菌［16］、黑曲霉［6］、蜡样芽胞杆菌［17］等。本课题组通过前期实验发现菌株BD6在液体培养基中具有高效Cr（VI）还原能力，于是本研究尝试将该菌株用于土壤修复。菌株BD6为微杆菌属，该菌属应用于Cr（VI）污染土壤修复还少见报道。由于土壤环境复杂，当使用微生物修复土壤时，各方面因素都会对微生物修复土壤的效果产生影响，如接种量、Cr（VI）初始浓度、温度和金属离子等［18-19］。本研究在考察菌株BD6在液体培养基中还原特性基础上［11］，通过单因素实验进一步确定了菌株在土壤中还原Cr（VI）的特性和条件，与菌株BD6在液体中的Cr（VI）还原条件相比，随着温度升高在液体或土壤中都有着还原率升高的趋势，但40℃时土壤中还原率明显好于液体还原；重金属离子在液体还原中对还原的抑制大小排序为Mn2+＞Cd2+＞Zn2+＞Ni2+，Cu2+有促进还原的作用，而在土壤中对还原的抑制效果没有液体中明显且抑制大小顺序为Cu2+＞Cd2+＞Ni2+＞Mn2+＞Zn2+。这可能与微生物所处的不同环境介质有关。Cr（VI）在土壤中的老化时间也可能会影响铬在土壤中的形态［20］，而微生物对不同形态的Cr（VI）去除效率可能不同［21］。本研究中菌株BD6对不同老化时间的土壤还原效率相近，由此可见，其适用于长时间受到Cr（VI）污染的场地中。

在Cr（VI）污染土壤生物修复方面，有研究表明外源电子供体类物质添加会起到较好的促进Cr（VI）还原的作用［22-23］。各种电子供体存在情况下微生物对铬还原活性不同，可能是因为还原酶对不同电子供体的电子接受能力不同［24］。微生物会对更有利于其生长的电子供体进行优先利用，因此提高菌株Cr（VI）还原能力需选择合适的电子供体［25-26］。本研究根据菌株BD6在液体培养基中可以通过添加电子供体来提升Cr（VI）还原效率的特点，在土壤修复中也尝试了相应的各种电子供体。通过比较发现在土壤中添加丙酮酸钠作为电子供体效果最好，而在液体培养基中使用丙三醇作为电子供体效果更佳，这可能跟土壤环境中丙酮酸钠更易被菌株利用有关。因此，应选用易分散、溶解性较好的物质作为微生物还原土壤中Cr（VI）的外源电子供体。但是考虑到修复成本等原因，本研究在土壤修复中依旧使用丙三醇作为电子供体。

在土壤修复中也要考虑外源物质添加后对土壤长远的影响，特别是对土著微生物群落的影响。本研究发现在Cr（VI）污染土壤中添加菌株BD6的修复过程中，若添加丙三醇则会对土壤微生物群落产生一定影响，短时间内能提高微生物丰度和多样性，可能一方面作为电子供体加快了Cr（VI）的还原从而降低土壤毒性，另一方面丙三醇作为外加碳源也能够促进微生物的生长。同时，从群落结构角度看，是否添加电子供体也有着较大的影响，在门水平上10 d时有无电子供体添加显示出较大差异，15 d两者有趋向一致的趋势；在属水平上，96 h两者群落结构由于BD6作为优势菌存在，两者差异不显著，而当10 d后，随着菌株BD6丰度逐渐减少，是否添加电子供体则对群落结构有较大影响。由图4-B可以看出菌株BD6在96 h左右的短期内一直是优势菌群，起到了重要的修复作用，而随着时间延长菌株BD6迅速减少变为非优势菌，通过qPCR也进一步证实了菌株BD6在土壤中的这种定殖规律和变化趋势，说明利用菌BD6修复土壤并不会使菌株长期存活于土壤中并与土著微生物产生竞争。

盆栽实验能够比较直观地反映出污染土壤的毒性，本研究以大豆这种常见的经济作物作为盆栽研究对象，发现不同浓度Cr（VI）污染土壤会对大豆生长产生影响，大豆植株会将铬吸收入体内，且与土壤的Cr（VI）浓度呈正相关，这一结果与文献［15］得出的结论相似。本研究将BD6用于土壤污染修复，最终得到了良好的修复效果，即植株生长良好，体内吸收铬的量显著降低，分析原因应该是Cr（VI）被还原为低毒性的Cr（III），Cr（III）更易被沉淀和固化下来而不易被植物吸收。

4 结论

菌株Microbacterium sp. BD6修复Cr（VI）污染土壤可以明显改善大豆植株生长情况，且降低植株体内铬含量，能够提升土壤中微生物多样性，对土壤质量有明显的改善作用。菌株BD6数量在修复土壤Cr（VI）污染过程中一直呈下降趋势，不会一直成为土壤中的优势菌，对土著微生物群落造成持续影响。