藏药蓝花荆芥的抑菌活性

马钰洁，高生英，叶 菊*

（1.青海民族大学药学院，青海西宁 810007；2.青海省青藏高原植物资源化学重点实验室，青海西宁 810007；3.青海省现代藏药创制工程技术研究中心，青海西宁 810007）

藏药“辛木头勤”为唇形科荆芥属植物蓝花荆芥（Nepeta coerulescens Maxim.）的干燥全草，生长于海拔2 000～4 800 m 的山坡、河滩、灌丛及林缘，为多年生草本，分布于西藏、青海、甘肃、四川等地。其味苦、微甘，性凉；功效为清疮热，清肝热、生肌、止血；常用于肝炎、牙周炎等的治疗[1]。本课题组在前期研究中发现其乙酸乙酯相和正丁醇相具有显著的抑菌作用，进一步从上述活性部位分离得到槲皮素、丹皮酚、N−反式阿魏酰酪胺、没食子酸、鞣花酸、对羟基苯甲酸、齐墩果酸、β−谷甾醇等14 个单体成分[2]。洪志伟等[3]研究了槲皮素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用及作用机制。黑育荣等[4]发现齐墩果酸对多种植物病原菌有抑制作用。闫莉等[5]研究了鞣花酸对变异链球菌的抑菌活性及作用机制。文献记载蓝花荆芥具有治疮疡、湿疹、皮肤溃烂、出血等症的作用，上述研究结果亦从药理学方面证实了蓝花荆芥有显著的抑菌活性。然而笔者未见相关蓝花荆芥抑菌成分及其药效的研究报道。本研究采用醇提法、萃取法、柱层析法制备了10 种单体化合物，以纸片法[6]检测以上成分对常见11 种细菌和3 种真菌的抑菌效果，为蓝花荆芥在抑菌领域的应用提供参考，为研制低毒、高效、优质的天然抑菌药物提供依据。

1 材料、仪器和试剂

1.1 实验材料

原药材于2018 年7 月采自青海省平安县夏宗寺，由青海民族大学药学院吉守祥教授鉴定为唇形科荆芥属蓝花荆芥。阴干，备用。

1.2 实验菌种

试验菌株均购自中国医学微生物菌种保藏管理中心（China Medical Culture Collection，CMCC）。1～11号为细菌，12～14号为真菌，详见表1。

表1 供试病原菌

1.3 实验仪器

PL202−L型电子天平（上海梅特勒−托利多仪器有限公司），SHB−Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），N−1100V−W型旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社），立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），SW−CJ−2FD型超洁净工作台（苏州净化设备有限公司），恒温振荡培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），MJX−160B−Z型霉菌培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），SPX−250B−Z型生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

1.4 实验试剂

齐墩果酸、熊果酸、槲皮素、鞣花酸、没食子酸、β−谷甾醇、木犀草素、对羟基苯甲酸、丹皮酚、芦丁（自制，纯度≥98%）；两性霉素、庆大霉素、氨苄青霉素钠（上海源叶生物技术有限公司）；营养琼脂、改良马丁氏培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司）；乙醇、乙酸乙酯、正丁醇（分析纯，天津市红岩试剂化工厂）；高纯水（青藏高原植物资源化学重点实验室）。

2 实验方法

2.1 供试样品制备

取蓝花荆芥药材9 kg，粉碎，95%乙醇水浴温热浸泡24 h，过滤，减压浓缩制膏。取浸膏适量，加水溶散，用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到不同极性部位。采用柱层析法从乙酸乙酯相和正丁醇相分离纯化得到10 个单体化合物。称取各单体化合物0.20 mg，分别用100µL DMSO溶解，备用。

2.2 菌、孢子悬液及混菌平板制备

将细菌接种到营养琼脂培养基上，37 ℃恒温培养18～24 h。将真菌菌种接种到改良马丁琼脂培养基上，28 ℃恒温培养3～5 d。

将细菌培养物移至100 mL、0.9%无菌氯化钠溶液，制成浓度为108 cfu/mL 的菌悬液。将真菌培养物移至5 mL、0.9%无菌氯化钠溶液（含0.05%(V/V)吐温80），并洗脱孢子。用移液枪吸取孢子悬液至无菌试管内，加入100 mL、0.9%无菌氯化钠溶液（含0.05%(V/V)吐温80）中，制成浓度为108 cfu/mL的孢子悬液。

取无菌培养皿，注入培养基20 mL，放置水平台面上使其凝固，作为底层。另取培养基适量加热至48～50 ℃（芽孢可至60 ℃），加入菌悬液或孢子悬液2 mL，摇匀。每个培养皿中分别加入5 mL 上述培养菌，使其在底层上均匀摊布，作为菌层，放置在水平台上冷却。作为阴性对照，备用。

2.3 活性测试

2.3.1 抑菌活性的初筛

取无菌培养皿，注入培养基20 mL，凝固。取供试细菌悬液和真菌孢子悬液各2 mL，分别移至150 mL培养基中，混合均匀，吸取5 mL 至培养皿中，待其凝固，制得混菌平板。

无菌条件下，取“2.1”项下供试品溶液润湿后的滤纸片，放至混菌平板上，37 ℃倒置培养1 d，记录药物的抗菌活性。

2.3.2 抑菌活性的复筛

按照“2.3.1”项同样方式制备混菌平板。

取阳性对照药品两性霉素B、氨苄青霉素钠、硫酸庆大霉素适量，加入DMSO，分别制成2 .00 g/L 溶液。无菌条件下，取上述对照溶液及复筛试验样品溶液润湿后的滤纸片，放至混菌平板上，供试细菌35～37 ℃培养18～24 h，供试真菌20～25 ℃培养24～48 h，用游标卡尺测量抑菌圈的直径，计算相对抑菌率。相对抑菌率=（样品平均抑菌直径−阴性对照平均抑菌直径）/阳性对照平均抑菌直径×100%。

2.3.3 最小抑菌浓度的确定（MIC）

按照“2.3.1”项同样方式制备混菌平板。

取复筛药物适量配制成2.0、1.0、0.5、0.25 g/L 浓度梯度的溶液，按照“2.3.1”项同种方式制备混菌平板。取上述浓度复筛药物溶液润湿后的滤纸片置于培养皿中，培养24 h，测量抑菌圈直径，并确定最小抑菌浓度。

3 结果

3.1 抑菌活性初筛结果

对蓝花荆芥极性部位分离纯化后的单体化合物抑菌活性进行了初步筛选，结果见表2。

表2 蓝花荆芥单体化合物抑菌活性初筛结果

如表2 所示，槲皮素、鞣花酸、对羟基苯甲酸、丹皮酚、没食子酸对酿酒酵母菌有较强的抑菌作用；齐墩果酸对蜡状芽孢杆菌有较强的抑制作用。β−谷甾醇、熊果酸、芦丁、木犀草素对供试菌并无抑制作用。其中鞣花酸对甲型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌都有显著的抑菌活性。现代药理学证实许多多酚类化合物具有广谱的抑菌效果。C.Zongo 等[7]发现大黄多酚对葡萄菌属具抑菌活性，并测定了最小抑菌浓度。陈孝娟等[8]发现石榴皮总多酚有一定的体外抑菌作用。黄素臻[9]发现牛蒡多酚对大肠杆菌等3个菌种有抑菌效果并测定了其最小抑菌浓度。申凯等[10]发现菱茎多酚对金黄色葡萄球菌等5个菌种有抑菌活性，对腐败希瓦氏菌及酿酒酵母菌较为敏感。鞣花酸作为一种多酚二内酯成分，其抑菌效果可以更进一步进行研究。故将鞣花酸作为复筛化合物，对其进行复筛试验[11]。

3.2 抑菌活性复筛

根据初筛，鞣花酸有显著抑菌效果，具有代表性。因此，分别以氨苄青霉素钠、庆大霉素和两性霉素B 作为阳性对照，进行复筛试验。对照结果见表3。

表3 鞣花酸抑菌活性复筛结果

如表3 所示，以氨苄青霉素钠为阳性对照，鞣花酸对甲型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为45.63%、56.11%；以庆大霉素为阳性对照，鞣花酸对甲型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌的抑菌率分别为40.18%、52.09%、39.57%、43.57%、59.26%；以两性霉素B为阳性对照，鞣花酸对酿酒酵母菌的抑菌率为63.03%。故鞣花酸对酿酒酵母菌、甲型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌都有较强的抑菌作用，对细菌大肠埃希菌和真菌酿酒酵母菌有较显著的抑菌作用。根据上述复筛结果，测定鞣花酸对于上述6种供试菌的最小抑菌浓度，明确鞣花酸的抑菌效果。

3.3 最小抑菌浓度MIC的测定

根据复筛结果，为了进一步明确鞣花酸对上述6种供试菌株的抑菌效果，对其进行了最低抑菌浓度(MIC)测定，结果见图1。

图1 不同浓度鞣花酸对不同菌种抑菌活性结果

如图1 所示，随着鞣花酸浓度的降低，对于不同供试菌的抑菌活性逐渐下降，浓度高于1.00 g/L 时均具有显著抑菌活性。对于金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、铜绿假单胞菌，4 个浓度下抑菌活性均具有显著性差异，浓度为0.25 g/L 时，无抑菌活性，可确定其最小抑菌浓度均为0.5 g/L；对于甲型副伤寒沙门菌，0.50 g/L 和0.25 g/L 浓度下的抑菌活性无显著差异。然而0.50 g/L 浓度下具有抑菌活性，可确定其最小抑菌浓度为0.50 g/L。故鞣花酸对于以上4 种菌种敏感度较高，最小抑菌浓度均为0.50 g/L。对于大肠埃希菌和酿酒酵母菌，浓度为2.00、1.00、0.50 g/L 时，抑菌活性均具有显著差异，浓度为0.50 和0.25 g/L 时不具抑菌活性，故鞣花酸对以上2 种菌种敏感度较低，最小抑菌浓度为1.00 g/L，较低浓度时无抑菌活性，只有较高浓度的样品才能发挥抑菌作用。

4 讨论

从正丁醇相分离纯化的齐墩果酸、槲皮素、鞣花酸、对羟基苯甲酸、丹皮酚、乙酸乙酯相分离的没食子酸具有较强的抑菌活性。正丁醇相分离的熊果酸、芦丁、木犀草素、乙酸乙酯相分离的β−谷甾醇对供试菌并无抑制作用。鞣花酸纯品对酿酒酵母菌、甲型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌均有显著的抑制作用。以鞣花酸作为复筛药物，对其抑菌活性进行复筛，通过阳性药品对照，计算对6种菌种的抑菌率，并确定对甲型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、铜绿假单胞菌的MIC为0.50 g/L，而对大肠埃希菌和酿酒酵母菌敏感度较低，MIC为1.00 g/L。

蓝花荆芥作为一种传统藏药，具有低毒、无污染、高效等特点，藏医常用于治疗疮疡、湿疹、皮肤溃烂等症。马凯琪等[12]从蓝花荆芥中筛选得到了7 种抗单纯疱疹1型病毒的提取物，但其相关抑菌活性研究未见报道。本研究从蓝花荆芥中分离得到的鞣花酸、齐墩果酸、槲皮素、丹皮酚、没食子酸等均具有显著的抑菌效果。张溪桐[13]发现丹皮酚对幽门螺旋杆菌有较好的抑菌活性且高剂量时抑菌率达82.90%。谢三都等[14]发现莲蓬醇提物对沙门氏菌等3个菌种具有抑菌活性，且与槲皮素浓度呈现正相关。吴悠等[15]发现低浓度齐墩果酸和二甲亚砜联合可有效抑制单一生物膜中粪肠球菌生长。张锡娇等[16]研究了没食子酸对水稻细菌性条斑病菌的抑菌作用及其作用机制。上述现代药理学研究结果和藏医应用证明蓝花荆芥是一种优良的抗菌抗病毒藏药。众所周知，铜绿假单胞菌在自然界分布广泛，水体、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有该菌存在，是多种疾病感染的主要病原菌，而现用抗生素都对其有耐药性，本研究发现蓝花荆芥富含的鞣花酸对于铜绿假单胞菌具有较好的抑菌效果，而且较为敏感，最小抑菌浓度为0.50 g/L。因此，将鞣花酸开发成抗铜绿假单胞菌药物是一种新的科研思路，也为从天然药物中寻找新型抗菌先导化合物提供实验依据。