不同栽培辅料诱导对3个香菇菌株液体发酵产漆酶活力的影响

熊雪　李鹏　王莹　向准　和耀威　万诚　王成考

摘要：以南方香菇产业主栽品种香菇808、庆科R20以及贵州省特有香菇马桑香菇为研究对象，通过拮抗反应、系统发育树及温度试验，对香菇菌株进行了区别性鉴定，并利用碱性木质素（纯品）及4种食用菌栽培中常用的栽培辅料为诱导物，研究3种不同香菇菌株液体发酵产漆酶活力连续12 d的变化规律。研究结果表明，马桑香菇、香菇808、庆科R20虽均同为有机香菇的下属分支，但菌株间是有区别的，马桑香菇同香菇808和庆科R20间的亲缘性也较远，且两两间均有拮抗反应，3种菌株菌丝生长对适宜温度的选择也有较小差异，存在一定种源差异。此外，香菇液体产漆酶活力受菌株遗传差异和5种不同诱导培养基的影响差异均为极显著（P<0.001），但各处理漆酶整体变化规律均呈现先升后降的趋势。对香菇808产漆酶诱导力最强的是玉米芯，其次为麦麸，最高漆酶活力分别为464.06、205.44 U/L;对庆科R20产漆酶诱导力最强的是麦麸，其次为玉米芯，最高漆酶活力分别为265.07、237.15 U/L;对马桑香菇产漆酶诱导力最强的是米糠，其次为麦麸，最高漆酶活力分别为178.34、161.83 U/L。从诱导漆酶活力强度出发，香菇808、庆科R20和马桑香菇培养的最佳辅料分别为玉米芯、麦麸和米糠。

关键词：栽培辅料;香菇;液体发酵;漆酶活力

中图分类号：S646.1+20.4 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2021）19-0172-08

木质纤维素作为自然界中储量巨大的潜在绿色资源，广泛存在于各种农林废弃物中，在自然界中主要靠微生物进行降解，主要包含纤维素、半纤维素、木质素和少量果胶^[1]。其中木质素是一种以1个或多个苯酚丙烷为单位组成的复杂聚合物，这类物质在自然界中主要被真菌代谢产生的胞外酶——多酚氧化酶降解^[2-3]。这类酶主要包括漆酶（Laccase）、多酚氧化酶（Polyphenolase）、过氧化物酶（Peroxidase）3类^[4]。其中，漆酶是分解木质素最具代表性的酶类^[5]，也是目前被广大学者研究最多的酶类。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，主要存在于植物和真菌中，其中植物漆酶主要参与形成木质素，而真菌漆酶的作用则是降解木质素^[6]。早在1988年，Bollag等就曾指出，漆酶分解木质素的同时会产生一些有毒物质，主要是酚类或醌类化合物，这些物质可抑制杂菌的生长，是很好的杀菌剂^[7]。严培兰等在对黑木耳（Auricularia auricula）的研究中也指出，漆酶活性高的黑木耳菌株，栽培产量也较高，其抗霉能力也高^[8]。任鹏飞等提出，菌丝的生物降解能力会受酶活大小的影响，通常来说产漆酶能力强的菌株其菌丝生长速度较快^[9-10]。唐菊等研究表明，漆酶在食用菌生长发育过程中除了参与培养料中木质素的降解，对原基分化、子实体的形态建成和发育还具有调控作用^[11]。众多研究表明，漆酶在食用菌生产中是一种可以间接反映食用菌菌丝活力、产量和品质，直接反映木质素降减情况的酶类。

食用菌产业的大力发展作为脱贫攻坚胜利的助力之一，也继续成为乡村振兴的重要抓手，其栽培规模广、用料大，给生态环境带来了一定压力。近年来，在贵州食用菌的栽培规模不断加大，品种主要是以香菇（Lentinula edodes）、木耳等木腐菌，在产量与产值喜人的同时不可避免地增大了木材用量的压力，其菌棒主要原料为木屑，棉籽壳、玉米芯、麦麸、秸秆、米糠等农林废弃物是常见的栽培辅料。本试验以南方香菇产业主栽品种香菇808、庆科R20以及贵州省特有香菇马桑香菇为研究对象，研究香菇菌株间的区别性差异，并利用碱性木质素（纯品）及棉籽壳、玉米芯、麦麸和米糠4种辅料为诱导物，探索3种香菇菌株在不同诱导培养基中液体发酵产漆酶活力变化，旨在为贵州省本土香菇生产中辅料的添加提供一定科学依据。

1材料与方法

1.1供试菌株

马桑香菇、香菇808及庆科R20菌株由贵州省食用菌工程技术研究中心提供，保存于贵州省生物研究所。

1.2培养基

1.2.1PDA培养基马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，去离子水1 000 mL，pH值自然，121 ℃灭菌30 min。

1.2.2PDA综合培养基马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，维生素B1 10 mg，琼脂粉20 g，去离子水1 000 mL，pH值自然，121 ℃灭菌30 min。

1.2.3种子液培养基马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖 20 g、酵母膏10 g，定容至1 L，121 ℃灭菌30 min。

1.2.4基础培养基（basic medium，BM）葡萄糖10 g、蛋白胨2 g、七水硫酸镁0.5 g、三水磷酸氢二钾1 g、磷酸二氢钾0.46 g，定容至1 L，121 ℃灭菌30 min。

1.2.5诱导培养基在“1.2.4”节中基础培养基配方基础上分别加入3 g孔径粒度为20～60目的碱性木质素（CK，BM+MZS）、棉籽殼（BM+MZK）、玉米芯（BM+YMX）、麦麸（BM+MF）、米糠（BM+MK），定容至1 L，121 ℃灭菌30 min。

1.3香菇菌株间的区别性鉴定

2021年3月，于贵州省生物研究所微生物实验室，将保存的马桑香菇、香菇808、庆科R20分别接种于PDA综合培养基平板上，25 ℃恒温活化培养8 d。

1.3.1拮抗试验接种组合为2组。第1组：同种供检菌种，于同一PDA平板上各接种1个接种块;第2组：供检菌株两两接种于同一PDA平板上。25 ℃ 相峙培养。

1.3.2建立香菇系统发育树采用购买的生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取分离纯化3种香菇菌株基因组DNA，提取之后的DNA选用真菌通用引物（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）进行PCR扩增。采用25 μL的PCR反应体系：Template（基因组20～50 ng/μL） 0.5 μL;10×Buffer（和Mg2+）;dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL;Taq 0.2 μL;前向引物（10 μmol/L）0.5 μL;后向引物（10 μmol/L）0.5 μL;加双蒸水至25 μL。反应程序为94 ℃预变性4 min;94 ℃变性45个循环，55 ℃退火45个循环，72 ℃延伸1 min，30个循环;72 ℃延伸8 min，4 ℃终止反应保存。扩增得到的PCR产物经1.0%琼脂糖电泳检测扩增结果后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序后登录GenBank对比，通过BLAST对测序结果进行比对分析，下载最相近菌株的ITS rDNA序列，并构建系统发育树。

1.3.3不同温度生长速度测定取3种香菇备用活化平板，使用打孔器打取直径5 mm接种物，接种于PDA平板上，分别置于10、15、20、25、30 ℃下培养，观察菌丝生长情况。菌丝生长速度测定采用“十”字交叉法，从菌丝萌发开始，每2 h测量1次，同时记录菌丝萌发时间，菌丝日均生长速度以吃料后菌落平均每日直径增长量统计。菌丝铺满平板时，观察记录菌落的菌丝形态、色泽、菌落形状、菌丝长势和边缘特征等，用“+”“-”表示菌丝的长势，“+”越多表示菌丝生长得越好、越健壮、均匀，“-”表示菌丝不生长。

1.4漆酶活力测定

1.4.1发酵培养使用打孔器打取直径5 mm接种物，每100 mL完全培养基中无菌条件下放入5个接种物，25 ℃、150 r/min 摇床避光培养。8 d后取匀浆机将三角瓶内的菌丝球搅拌30 s使其成均质体。分别向100 mL含不同基质培养料的诱导培养基（BM+MZS、BM+MZK、BM+YMX、BM+MF、BM+MK）中加入3 mL搅拌均匀的香菇均质体，于25 ℃、150 r/min摇床避光培养，每个处理4个重复。

1.4.2漆酶活力的测定参照韩美玲等的研究^[12]测定漆酶活力。从培养后2 d开始测定其漆酶活力，连续测至培养12 d。

1.5数据处理

利用EXCLE进行图表整理，SPSS Statistic 18.0对菌丝日均生长速度、漆酶活力数据分别进行显著性分析和双因素方差检验（two‐way ANOVA）。

2结果与分析

2.1香菇菌株间的区别性鉴定

2.1.1拮抗试验 从图1可以看出，马桑香菇、香菇808、庆科R20菌株自身均无拮抗反应，但马桑香菇同香菇808之间有轻微的隆起，庆科R20之间有明显的拮抗带，而香菇808同庆科R20间也有明显的拮抗带。综上说明，3种香菇菌株彼此间皆有拮抗反应，说明3种香菇菌株种源存在一定差异性。

2.1.2建立香菇系统发育树3种香菇菌株的DNA提取结果见图2，香菇菌株DNA条带清晰，DNA的浓度、纯度以及产率均比较高，可用于PCR扩增。

经PCR扩增和序列测定，结果显示3种香菇菌株rDNA ITS区段长度在700～800 bp之间，且所得序列经Blast搜索，击中结果均为Lentinula edodes，下载其相近序列15条，并结合香菇属其他种rDNA序列：Lentinula aciculospora、Lentinula boryana、Lentinula lateritia、Lentinula madagasiksrensis、Lentinula novaezelandiae 、Lentinula raphanica、Lentinula reticeps（每种随机挑选3条），共同构建系统发育树（图3）。系统发育树表明，同3种供试菌株rDNA序列亲缘性较高的香菇属种有Lentanus edodes、Lentinula lateritia、Lentinula novaezelandiae，且3种菌株集中于Lentanus edodes同一分支上，菌株间庆科R20和香菇808分支较近，相似系数较高，亲缘性较近，同马桑香菇的分支较远，相似系数低，亲缘性较远。说明3种香菇菌株虽同为香菇属下有机香菇，但仍存在一定差异。

2.1.3不同温度条件对3种香菇生长的影响从表1可以看出，在所选供试温度条件下，马桑香菇菌落为绒毛状白色圆形菌落，日均生长速度随温度的升高呈现先增后降的趋势，并于温度25 ℃条件下达

到峰值0.89 cm/d，且显著高于其他温度处理（P<0.05），其次依次为20 ℃（0.49 cm/d）、30 ℃（0.40 cm/d），且在20～30 ℃，菌丝长势最佳，其次为15 ℃。说明马桑香菇菌丝生长适宜温度范围为15～30 ℃，最佳生长温度为25 ℃。

在供试温度范围内，香菇808菌丝呈绒毛状白色圆形菌落，其日均生长速度随温度升高先增加后减少，并于25 ℃达到最大值0.85 cm/d。日均生长速度整体呈现出25 ℃>20 ℃（0.44 cm/d）>30 ℃（0.31 cm/d）>15 ℃（0.28 cm/d）的趨势，且在25、30 ℃条件下菌丝长势最佳。说明香菇808菌丝的适宜生长温度为20～30 ℃，最佳温度为25 ℃。

庆科R20在所设温度范围内，日均生长速度也随温度升高先增加后减少，峰值出现在25 ℃条件下，达0.89 cm/d，且长势最佳。日均生长速度其次依次为20 ℃（0.50 cm/d）、15 ℃（0.29 cm/d），长势也仅次于25 ℃。说明庆科R20的适宜生长温度范围为15～25 ℃，最佳温度为25 ℃。

综上可知，3种香菇菌株在所设温度范围下菌落形态受温度影响较小，菌丝生长随温度变化趋势大致相同，且菌丝生长速度在高温和低温下受胁迫明显，最适温度均为25 ℃，但3种菌株对中高温和中低温有不同的倾向性选择。

2.2不同菌株对漆酶活力的影响

双因素方差检验结果显示，香菇不同菌株在不同培养基中的产漆酶能力各不相同，且在整个培养过程中，除培养3 d外，菌株和培养基交互影响为显著（P<0.01）外，香菇液体产漆酶活力受菌株遗传差异和5种不同诱导培养基的影响均为极显著（P<0.001）。

从表2、图4可知，连续12 d测试中，同一诱导培养基上3种香菇菌株液体产漆酶活力差距明显，且菌株对漆酶活力皆具有极显著的影响（P<0001）。

整个培养过程中，在仅含碱性木质素的诱导培养基（BM+MZS）中马桑香菇菌株较其他2种菌株表现出更高的漆酶活力，且最大漆酶活力为 62.77 U/L 出现在培养9 d，香菇808最大漆酶活力为44.86 U/L出现在培养8 d，庆科R20在培养6 d方检测出较弱的漆酶活性，在培养11 d后漆酶活力较大，达30.97 U/L。在含棉籽壳（BM+MZK）、玉米芯（BM+YMX）的诱导培养基中，菌株香菇808分泌漆酶的能力明显高于其他菌株，最大漆酶活力均出现在培养9 d，分别为129.85、464.06 U/L;菌株马桑香菇和庆科R20最大漆酶活力值均在培养11 d，且马桑香菇分泌漆酶的能力最低，在BM+MZK培养基中仅为23.82 U/L，在BM+YMX培养基中为11781 U/L。在含麦麸的诱导培养基（BM+MF）中，菌株庆科R20具有较高的分泌漆酶的能力，并在培养10 d后达到最高，为265.07 U/L;菌株马桑香菇漆酶活力在培养8 d最先达到顶峰，但值较低，为161.83 U/L，且在达到极值后迅速下降;菌株香菇808在培养9 d出现极值，达205.44 U/L。在含米糠的诱导培养基（BM+MK）中，庆科R20的产漆酶能力最低，且培养前期较不稳定，在培养11 d出现极值，为45.07 U/L;而香菇808在培养培养 6 d 后漆酶活力急速上升，在培养8 d达到峰值为12464 U/L后缓慢下降;马桑香菇在培养到7 d后漆酶活力上升较快，并在培养11 d出现峰值为17834 U/L，随后快速降低。

综上所述，在培养初期所有处理下，3种香菇菌株产漆酶活力均较低，在培养中后期漆酶活力

较为旺盛，峰值也主要集中在培养8～11 d内。故以培养期所有处理漆酶活力均较为旺盛的培养9 d数据为依据可知，在含碱性木质素（BM+MZS）、米糠（BM+MK）的诱导培养基中，马桑香菇产漆酶活力高于其他菌株，分别为62.77、178.34 U/L;在含棉籽壳（BM+MZK）、玉米芯（BM+YMX）的诱导培养基中，香菇808产漆酶活力高于其他菌株，分别为129.85、464.06 U/L;而在含麦麸（BM+MF）的诱导培养基中，庆科R20分泌漆酶的能力最强，达 205.44 U/L。

2.3不同诱导培养基对漆酶活力的影响

由表2、图5可知，连续12 d测试中，3种香菇菌株液体产漆酶活力在不同培养基上均有不同表现，且5种诱导培养基对漆酶活力均具有极显著的影响（P<0.001）。

菌株马桑香菇、香菇808和庆科R20在5种不同诱导培养基发酵产漆酶活力均随培养时间呈现先增后降的趋势，达到峰值的时间有所差异，但主要集中在培养8～11 d。马桑香菇在5种不同诱导培养基上连续培养9 d时，在含米糠的诱导培养基（BM+MK）中分泌漆酶的能力最强，漆酶活力达137.76 U/L;其次为BM+MF培养基和BM+YMX培养基，分别達到88.67、63.13 U/L;而在含棉籽壳的诱导培养基（BM+MZK）中酶活仅为 19.27 U/L。香菇808在连续培养9 d时，在含玉米芯的诱导培养基（BM+YMX）上分泌漆酶的能力明显强于其他培养基，且出现峰值，酶活达464.06 U/L，同时在该天出现酶活峰值的还有BM+MZK、BM+MF培养基，酶活分别为129.85、209.44 U/L;而在仅含碱性木质素的培养基（BM+MZS）中，香菇808产漆酶的能力最低，仅为28.16 U/L，且该种培养基下，整个培养期日平均酶活力最高不超过34.86 U/L。因此，玉米芯对香菇808分泌漆酶的诱导能力明显强于麦麸、米糠、棉籽壳和碱性木质素。而对于庆科R20在培养初期（培养2 d），含麦麸的诱导培养基（BM+MF）中检测到的漆酶活力最强，达 5.58 U/L;含棉籽壳的诱导培养基（BM+MZK）在培养3 d才检测到微弱的漆酶活力，仅为0.51 U/L;酶活力最弱的是仅含碱性木质素的诱导培养基（BM+MZS），一直到培养6 d方才检测出较低的漆酶活力，仅为1.56 U/L;而在培养9 d时，BM+MF诱导培养基依旧保持最高的漆酶活力，达246.88 U/L，其次为BM+YMX诱导培养基，5种不同诱导培养基的漆酶活力趋势大致表现为BM+MF>BM+YMX>BM+MZK>BM+MK>BM+MZS;因此，庆科R20在含麦麸的诱导培养基中分泌漆酶的能力是最强的。

3讨论与结论

漆酶作为主要的木质素降解酶，参与香菇生长发育的每一个阶段^[13-14]。本试验以南方香菇产业主栽品种香菇808、庆科R20以及贵州省特有香菇马桑香菇为研究对象，研究香菇菌株间的区别性差异，并利用碱性木质素（纯品）及4种食用菌栽培中常用的基质培养料为诱导物，研究3种不同香菇菌株液体发酵产漆酶活力。研究结果表明，马桑香菇、香菇808和庆科R20虽均同为有机香菇的下属分支，但菌株间是有区别的，马桑香菇同香菇808和庆科R20间的亲缘性也较远，且两两间均有拮抗反应，3种菌株菌丝生长对适宜温度的选择也有较小差异，是存在一定种源差异的。此外，香菇液体产漆酶活力受菌株遗传差异和5种不同诱导培养基的影响均为极显著（P<0.001），但各处理漆酶整体变化规律均呈现先升后降的趋势。说明菌株和培养基的差异仅对漆酶活性大小有影响，但不影响漆酶的变化规律。本结果同Mata 等对香菇的研究结果^[15]相似，且在韩美玲等对糙皮侧耳的研究中也有类似趋势存在^[12，16]。此外，本试验培养前期，3种香菇菌株不同处理下产漆酶活力均较低，庆科R20菌株部分处理下甚至无法检测出漆酶活力，而在培养中后期漆酶活力较为旺盛，峰值也主要集中在培养 8～11 d内，表明香菇对木质素降解吸收时间普遍较晚。张权等研究发现，香菇生长过程中对营养的利用存在一定的先后顺序，在香菇液体发酵培养中发现淀粉优于纤维素和木质素被利用^[13，17]。杨舒贻等指出，香菇808液体培养中碳源淀粉较木质素更早被降解利用，且淀粉酶的最高活性出现在培养4 d，漆酶活力出现在培养13 d^[18]。本研究漆酶活力变化规律与之吻合。

此外，5种诱导物中，除碱性木质素（纯品）外，其他4种较为复杂的木质纤维素基质均为常见食用菌栽培辅料，也是农林生产中常见的二次资源。在众多研究中，麦麸一致被认为是有利于漆酶分泌的基质^[19-21]。本研究同样发现基质麦麸对香菇表现出较强的产漆酶诱导力，它能促使马桑香菇、庆科R20产酶时间提前，酶活峰值分别于8 d（马桑香菇，161.83 U/L）、10 d（庆科R20，265.07 U/L）出现。并且在麦麸诱导下庆科R20产酶能力最高，其次为基质玉米芯，麦麸诱导马桑香菇和香菇808的产酶能力分别仅次于米糠和玉米芯，表明辅料麦麸对庆科R20、马桑香菇和香菇808均有较强的漆酶诱导力。此外，玉米芯也表现出较高的产漆酶诱导力，香菇808在含玉米芯的诱导培养基下产漆酶能力最强，最高能达到464.06 U/L;玉米芯诱导庆科R20产漆酶的能力仅次于麦麸，最高达237.15 U/L;玉米芯对马桑香菇产漆酶的诱导能力相对米糠和麦麸较低，最高时能达117.81U/L。表明麦麸和玉米芯对香菇808和庆科R20均具有较强的产漆酶诱导力;而马桑香菇产漆酶活力受米糠和麦麸影响更大。这样的选择性差异可能是由于3种菌株遗传差异以及胞外蛋白质含量变化造成的。通过漆酶活性的对比研究，可初步得出香菇808、庆科R20和马桑香菇最佳辅料分别为玉米芯、麦麸和米糠，且3种菌株共同的最佳辅料为麦麸。马桑香菇在实现生产以来，菌棒配方均有别于香菇808和庆科R20，但生产中利用含米糠、麦麸和玉米芯的香菇栽培种配方生产马桑香菇在理论上是可行的，但更为具体的反应机制和降解过程还需结合其他几种胞外酶进行综合分析，而且能否保证马桑香菇的口感和丰富营养成分还需进一步研究。

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基金项目：贵州科学院青年基金（编号：黔科院J字[2021]18号）;贵州省科技计划（编号：黔科合重大专项字[2019]3004-4号、黔科合支撑[2019]2451-8-11号、黔科合重大专项字ZWCQ[2019]号3013-3、黔科合支撑[2019]2332号、黔科合支撑[2021]一般196）;贵州省食用菌产业体系项目野生菌保护抚育与驯化功能实验室建设专项。

作者简介：熊雪（1992—），女，贵州贵阳人，硕士，研究实习员，主要从事菌物生态及食用菌栽培相关研究。E-mail：604051569@qq.com。

通信作者：向准，硕士，副研究员，主要从事食用菌品种选育与栽培研究。E-mail：Xiangzhun@163.com。