析因设计动物实验筛选聚桂醇硬化治疗肝囊肿最佳方案

骆 晨，周 军，付 雪，李智博，覃艳丽，韦 力

(三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院超声科，湖北 宜昌 443003)

聚桂醇是疗效好且安全性高的硬化剂[1-2]，可用于有效治疗静脉曲张等血管类疾病[3]；随着微创治疗的普及和对药物本身作用机制的探索，其临床应用范围逐渐扩展。介入技术的引入为应用聚桂醇拓宽了途径，并在囊肿性疾病中展示出独特优势。肝囊肿与胆囊壁具有共同的胚胎组织来源、囊壁上皮细胞及分泌特点，故既往常选取兔胆囊进行实验研究[4-5]。在前期研究[6]基础上，本研究以兔胆囊模拟肝囊肿，通过析因设计筛选聚桂醇在体硬化治疗肝囊肿兔模型的最佳药物浓度与作用时间组合方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2～3月龄新西兰大白兔58只，雌雄不限，体质量(1.99±0.18)kg，购自湖北逸挚诚生物科技有限公司，动物质量合格证编号：42817300000548；饲养于三峡大学动物实验中心，动物许可证编号：SYXK(鄂)2017-0061。饲养条件：室温22℃，12 h昼夜交替，自由饮食饲养1周。

1.2 仪器与方法

1.2.1 制备肝囊肿在体模型 以10%水合氯醛麻醉实验兔并常规保定后，于右上腹肋缘下作长约7～8 cm斜切口，充分暴露肝脏及胆囊。观察胆囊管与胆囊血管的解剖关系，结扎胆囊管(避开胆囊动、静脉)，测量胆囊最大横径，之后抽尽胆汁记录胆囊容积。58只兔造模过程中死亡1只，3只因血管变异结扎失败导致胆囊缺血坏死被排除，最终54只造模成功(图1)。

图1 建立肝囊肿兔模型解剖图 A.兔胆囊三角区，黄箭指胆囊管，位于红色胆囊血管(绿箭)上方； B.结扎胆囊管，建成肝囊肿兔模型

1.2.2 分组及硬化治疗 采用两因素三水平析因设计方法，将54只造模成功兔随机分为9组，每组6只，以0.25%、0.50%、1.00%聚桂醇分别作用5、10、20 min。具体方法：根据分组原则，分别给予兔相应浓度聚桂醇，使胆囊呈充盈状态；达到对应作用时间后抽出硬化剂，旷置胆囊，并以生理盐水冲洗腹腔，用无菌纱布吸尽盐水，之后用3-0非吸收性缝线逐层关闭腹腔。继续标准条件下饲养1周。

1.3 相关指标观察 1周后以空气栓塞法处死实验兔，沿原手术切口再次打开腹腔，测量胆囊最大横径，评估硬化效果。取出胆囊，剪去周围肝脏组织，观察胆囊大小、颜色、硬度及血管网等一般情况。以10%甲醛溶液固定胆囊组织，行脱水、石蜡包埋，制成切片用于HE染色。光镜下观察各组胆囊壁全层切片病理改变及各层组织破坏程度。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0统计分析软件。计量资料以±s表示。以单因素方差分析比较各组动物体质量、胆囊最大横径及胆囊容积。采用两因素析因设计方差分析，按照正交实验有交互作用两因素最优水平取决于其交互作用最优水平的原则[7]，计算聚桂醇浓度与作用时间不同水平组合时交互作用的K值，确定两因素交互最优水平。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般资料比较 各组兔硬化治疗前体质量、胆囊最大横径及胆囊容积差异均无统计学意义(P均>0.05)，治疗后1周胆囊最大横径差异有统计学意义(P=0.033)。见表1。

表1 各组兔一般资料比较(±s，n=6)

表1 各组兔一般资料比较(±s，n=6)

组别体质量(kg)胆囊最大横径(mm)治疗前治疗后1周胆囊容积(ml)0.25%聚桂醇组 5 min亚组2.06±0.209.65±1.236.68±0.791.45±0.22 10 min亚组2.02±0.12 9.73±1.076.03±1.131.37±0.19 20 min亚组2.22±0.198.53±1.805.52±0.581.40±0.270.50%聚桂醇组 5 min亚组1.93±0.189.08±1.505.82±1.271.46±0.30 10 min亚组2.03±0.159.60±1.084.51±0.761.46±0.20 20 min亚组2.09±0.158.70±2.074.62±1.141.43±0.251.00%聚桂醇组 5 min亚组1.94±0.248.41±1.784.85±0.98 1.35±0.33 10 min亚组2.06±0.2110.16±1.495.27±0.571.51±0.23 20 min亚组1.94±0.279.19±1.735.18±0.671.42±0.25F值0.7750.806 2.8860.231P值0.6270.6010.0330.983

2.2 聚桂醇注入前后胆囊变化

2.2.1 大体观 治疗前胆囊充盈良好，壁上血管走行清晰可见。硬化治疗后1周，自肝脏剥离的胆囊组织质地稍硬，胆囊体积较硬化前缩小，囊壁轮廓尚正常、形态欠饱满，色灰白，弹性差，未见血管网，部分囊内可见少量分泌物。见图2。

图2 1.00%聚桂醇10 min亚组胆囊大体观 A.聚桂醇硬化治疗前，胆囊充盈良好，壁上可见血管走行(箭)； B.硬化治疗后1周，离体胆囊壁灰白，触之稍硬，未见血管网

2.2.2 病理表现

2.2.2.1 0.25%聚桂醇 硬化治疗后1周，5、10 min亚组胆囊黏膜仍可见单层柱状上皮，上皮结构轮廓清晰、皱襞完整，排列尚整齐，仅见少量上皮细胞倒伏、紊乱、脱落，炎性细胞浸润，肌层未受影响；20 min亚组少量黏膜皱襞紊乱，黏膜上皮细胞出现坏死、脱落。见图3。

图3 0.25%聚桂醇各亚组细胞硬化情况(HE，×200) A.5 min亚组，黏膜上皮细胞紊乱、尚未明显脱落(箭)； B.10 min亚组，上皮细胞崩解，炎性细胞浸润(箭)； C.20 min亚组，上皮细胞脱落、坏死(箭)

2.2.2.2 0.50%聚桂醇 硬化治疗后1周，5 min亚组胆囊黏膜轮廓尚存，上皮细胞大部分仍完整，仅少量上皮细胞坏死脱落；10 min亚组大部分上皮细胞全层破坏，黏膜部分轮廓尚可见；20 min亚组绝大部分黏膜结构破坏，上皮细胞全层坏死、脱落，硬化累及肌层清晰可见。见图4。

图4 0.50%聚桂醇各亚组细胞硬化情况(HE，×100) A.5 min亚组，黏膜轮廓尚存，上皮细胞大部分仍完整，仅少量上皮细胞出现坏死脱落； B.10 min亚组，黏膜上皮细胞全层坏死、脱落(箭)； C.20 min亚组，黏膜层结构被破坏(箭)，肌层硬化

2.2.2.3 1.00%聚桂醇 硬化治疗1周后，各亚组均出现不同程度囊壁变性坏死。5 min亚组局部黏膜上皮细胞全层崩解，残留少数黏膜上皮细胞残影；10 min亚组黏膜上皮结构基本消失，黏膜下肌层见少量出血；20 min亚组上皮细胞完全脱落、坏死，未见正常黏膜结构，黏膜下肌层大量红细胞浸润。见图5。

图5 1.00%聚桂醇各亚组细胞硬化情况(HE，×100) A.5 min亚组，边缘局部上皮细胞裂解(箭)； B.10 min亚组，黏膜层轮廓消失(箭)，黏膜下肌层部分见少量红细胞浸润； C.20 min亚组，黏膜下肌层大量出血(箭)

2.3 浓度与时间交互作用 以各组治疗后胆囊最大横径作为评价指标进行析因设计，结果显示聚桂醇浓度与作用时间对硬化治疗效果的影响存在交互作用(P=0.019)；分析作用时间的单独效应，不同作用时间胆囊最大横径差异有统计学意义(P=0.001)；分析聚桂醇浓度的单独效应，不同药物浓度间胆囊最大横径差异无统计学意义(P=0.317)。见表2。两因素析因设计组合中，0.50%聚桂醇浓度作用10 min时K值最大(6.19)，即硬化治疗效果最好，见表3。

表2 两因素析因设计方差分析结果

表3 两因素析因设计组合K值

3 讨论

目前超声引导下聚桂醇硬化已成为治疗囊肿类疾病的理想方案，通过破坏囊壁上皮细胞阻止囊液分泌达到治疗目的，是安全可靠、简便有效的微创介入治疗方法。研究[8-9]表明聚桂醇用于超声引导下介入治疗囊肿效果显著，能于80%患者缓解临床症状，但目前仍处于经验性治疗阶段，对其药物浓度及作用时间等尚无定论。探索硬化治疗有效浓度与硬化作用时间的最佳组合对临床应用聚桂醇意义重大。胆囊横径变化可作为评估胆囊体积变化的指标，常规超声与超声造影条件下，胆囊横径与胆囊体积均具有良好的相关性。本研究以兔胆囊最大横径为观察指标，评估硬化后胆囊体积变化，分析硬化治疗效果。

聚桂醇作用效果具有浓度依赖性。前期研究[6]证实，留置浓度0.25%聚桂醇作用 10 min后抽出，对囊肿的治愈率为50%，留置不抽出治愈率可达87.5%；而浓度为0.125%时，即使留置不抽出，也仅37.5%产生疗效，提示0.25%聚桂醇可能是囊肿硬化治疗的最低有效浓度。故本实验以0.25%为最低浓度，观察聚桂醇对模型的硬化疗效。

硬化剂作用时间亦为影响硬化疗效的关键因素。作用时间不足导致柱状上皮细胞残留，可继续生长而致治疗失败。目前关于聚桂醇作用时间对硬化疗效影响的文献较少。KOBAYASHI等[10]观察聚桂醇浓度与作用时间对细胞死亡的影响，以体外培养内皮细胞为研究对象，发现采用1.5%聚桂醇，给药后15 s细胞即死亡，浓度为0.3%时作用15 min后细胞死亡；稀释至0.003%时，作用60 min甚至更长时间细胞也不会死亡。高浓度聚桂醇可导致细胞在短时间内死亡，而在较低浓度下细胞死亡所需时间延长，甚至增加作用时间亦不能达到硬化治疗效果。本实验中聚桂醇浓度为0.50%、硬化时间5 min时，仅少量上皮细胞坏死脱落，大部分黏膜结构仍存在；0.50%聚桂醇作用10 min亚组上皮细完全损伤，而浓度0.50%、作用时间20 min亚组黏膜下肌层已受到影响，提示作用时间过长可能损伤囊肿周围正常组织。

与目前医学科研中广泛应用的单因素多水平研究方法相比，析因设计可同时考察多因素多水平，在现代医学研究中具有方法学上的重要意义。本研究采用析因设计实验，不仅能分析影响硬化治疗效果的因素，还可筛选出最优治疗参数。本研究结果表明，聚桂醇浓度与作用时间之间存在交互作用。显微镜下可见0.50%聚桂醇作用10 min时黏膜轮廓已破坏，出现上皮细胞全层脱落坏死，进一步统计分析结果证实该组硬化疗效最显著，说明该组合可使上皮细胞发生不可逆坏死，达到理想治疗效果。聚桂醇浓度为1.00%时对囊壁损伤较大，黏膜上皮细胞脱落、囊腔碎屑残留、黏膜下层水肿、炎性细胞及红细胞浸润，纤维组织增生，致使硬化后胆囊横径值反而增大。

综上所述，聚桂醇在体硬化治疗肝囊肿兔模型的药物浓度与作用时间最佳组合方案为0.50%、10 min。