杨木联产低聚木糖和枯草芽孢杆菌的研究

文沛瑶,游佳欣,徐 勇,张军华*

(1.南京林业大学 化学工程学院,江苏 南京210037;2.西北农林科技大学 林学院,陕西 杨凌712100)

杨树具有生长快、分布广、易栽培的特点,故而常用于制备生物基化学品[1]。杨木中含有大量的木聚糖和纤维素组分,可通过化学法或生物法降解来制备低聚木糖(XOS)和单糖[2-3]。XOS具有益生元活性,在医药、食品及卫生领域有着巨大的应用前景[2]。乙酸(AC)水解是一种较为绿色的生物质预处理方法,被广泛用于制备XOS[3-5]。Wen等[3]使用5%乙酸在170℃下对杨木处理了30 min,低聚木糖得率为55.8%。Zhang等[4]采用pH值2.7的乙酸在150℃下处理玉米芯30 min,XOS得率达45.91%。枯草芽孢杆菌是常见饲料添加剂之一,它可以提高饲料转化率,促进动物消化并增强动物免疫力[6]。乙酸水解杨木后得到的固形物中仍含有较多纤维素和木聚糖,经纤维素酶水解后可以得到可发酵糖如葡萄糖、木糖,它们可以作为枯草芽孢杆菌生长的碳源,这样既可以提高杨木的利用价值,又可以减少枯草芽孢杆菌的生产成本。然而,杨木在经过乙酸水解后,其固形物酶水解的可发酵糖(葡萄糖和木糖)得率均低于30%。乙酸水解杨木后固形物中较高的木质素质量分数(超过30%)是可发酵糖得率较低的主要原因[3,5]。因此,寻找一种高效的预处理方式移除乙酸水解杨木后固形物中的木质素,改善杨木酶水解效率是后续发酵培养枯草芽孢杆菌的关键之所在。本研究以杨木屑为原料,乙酸水解制备低聚木糖后,采用不同的预处理方式对乙酸水解杨木后的固形物进行二次预处理,对比二次预处理对杨木化学组成、结构及酶水解特性的影响,最后利用获得的酶水解液发酵培养枯草芽孢杆菌,以期为后续杨木联产低聚木糖和枯草芽孢杆菌研究提供新方向,同时为杨木的高效转化和利用提供理论数据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

杨木屑收集于江苏省宿迁市,粉碎过0.25 mm筛,备用。乙酸、氢氧化钠、双氧水(质量分数30%)、氨水(质量分数26%)、γ-戊内酯(GVL)、硫酸(质量分数98%),均为市售分析纯。

纤维素酶CTec2,滤纸酶活[7]为123.0 FPU/mL,购于丹麦Novozymes公司。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YS01,由南京林业大学生物工程系生物化工研究所保藏。自制活化培养基:1%葡萄糖,1%鱼粉蛋白胨,0.5%酵母膏,1%NaCl,pH值7.0。琼脂固体培养基:0.5%鱼粉蛋白胨,0.25%酵母膏,0.1%葡萄糖,1.5%琼脂,pH值7.0,用于平板计数法计算枯草芽孢杆菌菌体浓度。自制发酵培养基:1%鱼粉蛋白胨,0.15%K2HPO4,0.01%MnSO4,0.05%MgSO4,0.02%CaCl2。

ATY224型电子天平;YXQ-LS-50A型立式压力蒸汽灭菌器;HH-SB型超级恒温油浴锅;L550型台式高速离心机;ZWY-240型恒温培养振荡器,上海智城分析仪器制造有限公司;Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪,安捷伦科技有限公司;Dionex ICS-5000高效液相离子色谱,赛默飞世尔科技有限公司;SBA-40C型生物传感分析仪,山东省科学院生物研究所。

1.2 杨木屑的两步预处理

1.2.1乙酸水解将杨木原料2.5 g和体积分数5%的乙酸溶液按照料液比1∶10(g∶mL,下同)充分混合,浸泡1 h后从25℃油浴升温至170℃,分别预处理30和50 min。反应完毕后,立即冷却,离心机10 000 r/min离心5 min,回收预处理液,测定低聚木糖(XOS)含量。水解后固形物用蒸馏水洗涤至中性,置于-19℃冰箱中,备用于第二步预处理。预处理液中木糖和XOS得率基于预处理液中木聚糖含量计算。

1.2.2第二步预处理

1.2.2.1NaOH预处理 取乙酸水解杨木后的固形物2.5 g,将配制的质量分数1%NaOH溶液和固形物按液料比10∶1混合后,于120℃下预处理1 h。

1.2.2.2NaOH-H2O2预处理 取乙酸水解杨木后的固形物2.5 g,将含有质量分数1%NaOH和质量分数1%H2O2的混合液和固形物按液料比10∶1混合后,于120℃下预处理1 h[8]。

1.2.2.3NH3·H2O预处理 取乙酸水解杨木后的固形物2.5 g,将质量分数26%氨水和固形物按液料比10∶1混合后,于70℃下预处理24 h[9]。

1.2.2.4γ-戊内酯预处理 将戊内酯和水按体积比8∶2混合,加入100 mmol浓硫酸,作为预处理液。取乙酸水解杨木后的固形物2.5 g,按液料比10∶1加入预处理液[10],混合后于140℃下预处理1 h。

1.2.2.5乙酸-双氧水(HPAC)预处理 将乙酸-双氧水按照体积比1∶1混合,蒸馏水稀释乙酸-双氧水溶液至体积分数80%作为预处理液。取乙酸水解杨木后的固形物2.5 g,加入100 mmol浓硫酸[3]后,按液料比10∶1加入预处理液,和固形物混合后于60℃下预处理2 h。

第二步预处理后,分别抽滤使固液分离,液体冷冻于-20℃冰箱中,固体用于后续组分测定和酶水解实验。

1.3 杨木酶水解

称取两步预处理后的样品0.04 g于离心管中,加入纤维素酶和pH值5.0的柠檬酸钠缓冲液,配制成底物质量分数2%(以体系的总质量计)的水解液2 mL。分别按5、10、15和20 FPU/g(以干物质计,下同)添加纤维素酶CTec2,将离心管置于恒温培养振荡器中在50℃、200 r/min条件下水解72 h。水解完成后,将样品煮沸10 min灭活,冷却后,离心10 min(10 000 r/min),取上清液测定葡萄糖和木糖,根据文献[3]的公式计算酶水解的葡萄糖和木糖得率。

1.4 酶解液培养枯草芽孢杆菌

1.4.1菌种活化 将保存于-18℃的枯草芽孢杆菌菌粉接种于活化培养基中,在37℃、150 r/min条件下培养24 h;使用灭菌后的接种环蘸取少许菌液,在琼脂培养基上进行平板划线操作,将划线后的培养基置于37℃培养箱中培养24 h;挑取单菌落接种至灭菌后的活化培养基中,在37℃、150 r/min条件下培养24 h即得到活化后的菌种。活化后的菌种用于后续发酵培养枯草芽孢杆菌。

1.4.2发酵培养枯草芽孢杆菌以二次预处理后的杨木酶水解液为碳源,加入乙酸和乙酸-双氧水(AC-HPAC)两步预处理杨木酶水解液使发酵液体系中葡萄糖质量分数为1%。然后加入1.1节配制的发酵培养基,在37℃、150 r/min、接种量5%、装液量为20/50 mL(在50 mL三角瓶中装入20 mL发酵液)的条件下发酵培养枯草芽孢杆菌。同时,以葡萄糖(初始质量浓度6.77 g/L)为碳源作对照。发酵过程中在不同时间点检测pH值、OD值、葡萄糖浓度和木糖浓度,考察其对枯草芽孢杆菌生长曲线的影响。

1.5 表征分析

1.5.1组分测定杨木样品的组分参照美国可再生能源实验室(NREL)的方法[11]测定。

1.5.2糖含量测定葡萄糖、木糖和低聚木糖均参考文献[3]中的方法测试。葡萄糖和木糖的浓度采用Agilent 1260高效液相色谱分析,分析柱为Aminex HPX-87H,检测器为示差折光检测器,色谱柱温度45℃,流动相是5 mmol/L的H2SO4,流速为0.5 mL/min。低聚木糖浓度采用Dionex ICS-5000高效液相离子色谱测定,色谱柱为Carbon Pac PA200,采用100 mmol/L NaOH和500 mmol/L NaAc进行梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,柱温为30℃,四电位脉冲安倍检测器(PAD)检测。

1.5.3光密度值的测定采用比浊法,取1.0 mL发酵液于1.5 mL离心管中离心(10 000 r/min,5 min),沉淀中每次加入1.0 mL 0.9%的生理盐水润洗,最后将其溶于1.0 mL的蒸馏水中,稀释适当倍数后在600 nm处用1.0 cm光径的比色皿测定吸光度(A600),A600乘以稀释倍数即为600 nm处的光密度(OD600)值。

1.5.4菌体浓度的计算将菌液逐级稀释,振荡混匀,取100μL涂布平板,37℃于琼脂固体培养基中培养24 h后,按平板计数法选取菌落数30～300为有效计数平板,按菌落形成单位(CFU)进行计数。依照下式计算菌体浓度(CCFU,CFU/mL):

式中:C—某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,CFU;V—涂平板时所用稀释液的体积,mL;M—稀释倍数。

1.5.5生长曲线的绘制[12]取若干个150 mL已灭菌的锥形瓶,各装入20 mL发酵培养基,pH值为7.0,接种量为5%,37℃,150 r/min培养0～36 h,每个时间点进行pH值、OD600、糖含量、菌体浓度的测定,以时间为横坐标,pH值、OD600、糖含量和菌体浓度为纵坐标绘制菌的生长曲线。

2 结果与讨论

2.1 乙酸水解制备低聚木糖

当乙酸水解时间为30和50 min时,预处理液中的XOS得率分别为55.8%和39.0%[3],较高的得率表明乙酸水解是一种高效制备XOS的方法[13]。然而,经过乙酸水解后,杨木在进一步的酶水解中葡萄糖得率低于25%。这一结果是由于乙酸水解使底物中的木质素质量分数(大于35%)增加,降低了纤维素酶对杨木纤维素的可及性及水解效率[2-3,13]。因此,为实现乙酸水解杨木中的多糖更高效地转化为可发酵单糖,探讨高效的预处理方法脱除木质素组分是改善杨木酶水解效率的必要手段[14]。

2.2 第二步预处理方法的影响

2.2.1杨木化学组分 以乙酸水解杨木30 min后的固形物为底物,研究了NaOH、NaOH-H2O2、NH3·H2O、γ-戊内酯(GVL)、HPAC等预处理方法对底物化学组成的影响(表1)。经过不同方式预处理后,底物中的木聚糖和木质素含量均有所降低,经NaOH和HPAC预处理的底物中木聚糖质量分数甚至降到3%以下,表明这2种预处理方式均对固形物中残留的木聚糖有着较强的脱除作用。经HPAC预处理后总木质素质量分数最低(4.4%),这就表明这几种预处理方式中HPAC最适合用于杨木木质素的移除[15-16]。

表1 不同预处理对乙酸水解杨木(30 min)化学组成的影响Table 1 Effects of different pretreatments on the composition of AC-pretreated poplar(30 min)

以乙酸水解杨木50 min后的固形物为底物时,γ-戊内酯预处理后底物的酸不溶木质素质量分数从36.1%降至10.3%(表2),这表明γ-戊内酯预处理对底物有着较好的木质素移除效果。经HPAC预处理后,底物中的木质素质量分数低于0.5%,证实了HPAC预处理也对杨木有着很强的木质素移除能力[15-16]。需要注意的是,经过HPAC预处理后底物中木聚糖质量分数仅为3.0%,这说明该预处理方法在移除木质素的同时移除了较多木聚糖。综上,HPAC预处理是脱除酸解杨木中木质素最优的预处理方法。

表2 不同预处理对乙酸水解杨木(50 min)化学组成的影响Table 2 Effects of different pretreatments on the composition of AC-pretreated poplar(50 min)

2.2.2杨木酶解结果杨木经乙酸水解30 min后再经第二步预处理,然后经纤维素酶水解,所得葡萄糖和木糖得率均有所提升(表3)。其中,NH3·H2O预处理后样品的葡萄糖和木糖的得率均较低(不到20%)。在酶水解过程中,无定型纤维素相对结晶纤维素更容易水解[2]。因此,NH3·H2O预处理中溶解部分无定型纤维素会导致结晶纤维素含量相对升高,这可能是导致NH3·H2O预处理后底物水解葡萄糖得率较低的原因[9,17]。从表3中水解得率的数据可以看出,预处理效果大小的顺序依次是:HPAC、NaOH、NaOH-H2O2、GVL、NH3·H2O预处理。

表3 不同预处理对乙酸水解杨木(30 min)酶水解的影响Table 3 Effects of different pretreatments on the enzymatic hydrolysis of AC-pretreated poplar(30 min)

以乙酸水解杨木50 min的固形物为原料时,分别采用NaOH、NaOH-H2O2、NH3·H2O预处理后,酶水解所得葡萄糖得率均低于35.0%(表4),但是略高于以乙酸水解杨木30 min的底物(得率＜30%)。经HPAC预处理后底物的葡萄糖得率为62.3%,高于其他4种预处理后底物的葡萄糖得率。

表4 不同预处理对乙酸杨木(50 min)酶水解的影响Table 4 Effects of different pretreatments on the hydrolysis of AC-pretreated poplar(50 min)

当纤维素酶添加量为20 FPU/g时,加入1.0 g/L吐温80后,经乙酸水解50 min及乙酸-双氧水两步预处理后杨木酶解的葡萄糖和木糖得率分别从62.3%和71.0%提升至97.1%和98.1%(图1)。表明吐温80对杨木的酶水解性能有着较强的促进作用。这可能是因为吐温80减少了酶在底物表面的非生产性吸附,提高了纤维素酶稳定性[18]。当纤维素酶添加量减少至10 FPU/g时,葡萄糖得率仍高达96.1%。在相同酶水解条件下,30 min乙酸水解杨木经二次预处理后的酶水解葡萄糖得率为93.8%,二者葡萄糖得率较为接近。由于30 min乙酸水解杨木已能获得更高的低聚木糖(得率55.8%),水解更长时间,50 min低聚木糖得率(39.0%)反而降低,故采用乙酸水解杨木30 min的底物作为后续制备酶水解液的底物。

图1 吐温80对AC-HPAC预处理后杨木酶水解的影响Fig.1 Effect of Tween 80 on the hydrolysis of AC-HPAC-pretreated poplar by cellulase

2.3 酶水解液培养枯草芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌是一种多功能的微生物,不仅可用于植物生物防护以及动物饲料的添加菌剂,而且在污水处理及生物肥发酵中应用也相当广泛[6]。葡萄糖可以作为培养枯草芽孢杆菌的主要碳源。当以葡萄糖为碳源时,在发酵的前12 h,随着发酵时间延长,酶水解液中的葡萄糖浓度逐渐降低、枯草芽孢杆菌菌体浓度逐渐增加(图2(a))。经过12 h发酵后,葡萄糖质量浓度由6.8 g/L降低至0.1 g/L,葡萄糖利用率为99.3%,此时的枯草芽孢杆菌的菌体浓度最高可达到2.1×109CFU/mL。当发酵时间大于12 h后,枯草芽孢杆菌的菌体浓度开始降低,这可能是发酵液中葡萄糖消耗完所致。经过发酵3 h后,发酵液pH值降低,这可能是发酵中产生了部分有机酸所致。

生物质酶水解液中含有大量的可发酵糖可为枯草芽孢杆菌的发酵提供丰富的碳源。李情敏等[6]使用玉米酶解液在pH值5、温度37℃、接种量6%、转速200 r/min条件下培养枯草芽孢菌19 h后,发酵液的OD600值可达7.38。在本研究中,当以经过两步预处理后的杨木酶水解液作为碳源时,在0～2 h为枯草芽孢杆菌生长的迟缓期,2～11.5 h菌体浓度急剧增加,11.5 h后枯草芽孢杆菌生长进入稳定期(图2(b))。在发酵的前11.5 h,随着发酵时间延长,酶水解液中的葡萄糖浓度大幅度降低、木糖浓度缓慢降低、枯草芽孢杆菌菌体浓度明显增加。经过11.5 h的发酵,枯草芽孢杆菌的菌体浓度最高可达到2.1×109CFU/mL,此时酶水解的葡萄糖利用率为95.3%,木糖利用率为25.0%。在13 h后发酵液中的葡萄糖和木糖利用率分别可达99.1%和32.9%,26 h后木糖利用率也达到92.6%,这说明葡萄糖和木糖均可用于枯草芽孢杆菌的生长,但葡萄糖比木糖优先被枯草芽孢杆菌利用。在发酵过程中,经过13 h后,葡萄糖质量浓度降低了9.7 g/L,而26 h后木糖质量浓度仅降低了1.5 g/L,这表明枯草芽孢杆菌对木糖的利用速率远低于葡萄糖。酶水解发酵液培养的枯草芽孢杆菌菌体浓度接近葡萄糖为碳源培养的菌体浓度,这说明杨木酶水解液增殖枯草芽孢杆菌的效果和葡萄糖相近。除含有葡萄糖和木糖外,酶水解液中还含有0.36 g/L乙酸、0.07 g/L乙酰丙酸和0.04 g/L的5-羟甲基糠醛,上述物质均会不同程度地影响枯草芽孢杆菌的生长。因此,在采用酶水解液进行发酵前可采用活性炭吸附或石灰中和的方法去除酶水解液中的抑制物[19],以进一步提高枯草芽孢杆菌的菌体浓度。

图2 葡萄糖(a)和杨木酶水解液(b)分别培养枯草芽孢杆菌的生长曲线Fig.2 The growth curves of the B.subtilis cultured by glucose(a)and enzymatic hydrolysates from poplar(b)

3 结 论

3.1乙酸水解杨木(2.5 g)制备低聚木糖的最适条件为:温度170℃,乙酸体积分数5%,反应时间30 min。该条件下低聚木糖得率为55.8%(基于预处理液,下同),预处理延长至50 min时,低聚木糖得率降为39.0%。

3.2比较了氢氧化钠、氢氧化钠-双氧水、氨水、γ-戊内酯和乙酸-双氧水预处理对乙酸水解杨木化学组成和酶水解特性的影响,结果表明:乙酸-双氧水预处理具有最好的脱木质素效果,同时可获得最高的酶水解效率。

3.3吐温80可以降低纤维素酶的使用量至10 FPU/g DM,并提高乙酸和乙酸-双氧水两步预处理杨木的酶水解中葡萄糖得率至93.8%。

3.4以乙酸和乙酸-双氧水两步预处理杨木的酶水解液为碳源,经11.5 h培养得到的枯草芽孢杆菌菌体浓度最高可达到2.1×109CFU/mL,此时酶水解的葡萄糖利用率为95.3%,木糖利用率为25.0%。