一株纤维素降解菌的筛选、鉴定及产酶条件优化

钟 斌，陶文玲，倪思毅，安雪姣，夏 祥，张庆华

（江西农业大学 生物科学与工程学院，江西 南昌 330045）

【研究意义】中国是一个传统的农业大国，近年来，随着农村产业结构的调整，养殖业的规模日发壮大，农业生产也越来越集中，随之带来的大量农业废弃物无法得到有效的利用[1-2]。就作物秸秆而言，虽然目前已有秸秆还田的实例，但是依然有大量的秸秆被焚烧，严重威胁着大气和土壤的生态健康。根据《第二次全国污染源普查公报》显示[3]，仅2017 年，我国的秸秆产生量为8.05 亿吨，农业生产带来的污染已成为威胁农村生态，乃至地球生态的一大隐患，解决农业生产对土壤、大气、水体的污染问题迫在眉睫。厌氧消化是解决农业废弃物、市政生活垃圾等有机废弃物的一大重要途径[4]。但是，随着我国沼气工程的发展，每年产生的沼渣、沼液高达1.3 亿吨，如何在连续运行的沼气工程中将沼渣进行无害化处理，是制约沼气工程可持续发展的关键因素之一[5-6]。【前人研究进展】沼渣是厌氧消化的残余物，其中含有丰富的有机质，包括未能降解的木质纤维素和丰富的氮、磷、钾等矿质元素，但由于其过高的含水率以及厌氧发酵产生的毒害物质，并不适合直接施用[7-8]。好氧堆肥是在有氧的条件下，通过微生物将废弃物中的有机质降解，使得堆体温度升高，并杀灭其中的病原微生物，最后得到富含腐殖质物质[9-10]。然而，木质纤维素是大量存在于沼渣中的一种极难被降解的物质，在自然堆肥中，由于土著微生物种类和数量的不足，导致木质纤维素的降解不充分，使得自然堆肥存在许多问题，如堆肥时间长、腐熟不彻底、营养成分散失过多等。纤维素降解菌是一类能分泌木质纤维素降解酶系的微生物，通常包括霉菌、芽孢杆菌等。大量的研究报道在堆肥内添加纤维素降解菌能促进堆肥快速腐熟，从而缩短堆肥所需的时间[11-12]。刘艳婷等[13]将黄孢原毛平革菌、黑曲霉和地衣芽孢杆菌联合接种至猪粪堆肥中，发现添加外源菌剂后能显著促进堆肥的腐熟进度、重金属钝化以及在氮素的保留方面有着较为显著的效果。Choińska-Pulit等[14]的研究证实了接种物对堆肥中矿物质的转化和堆肥的腐熟程度具有积极的作用。【本研究切入点】虽然对纤维素降解菌的分离筛选已有很多，但是应用在堆肥上的纤维素降解菌仍然局限在已有的几种霉菌和芽孢杆菌上[15-16]。并且由于堆肥原材料的异质性和动态的堆肥过程，其中的理化环境非常复杂。目前，关于沼渣堆肥中纤维素降解菌的分离和应用鲜有报道，因此，有必要分离出能应用于沼渣堆肥中的纤维素降解菌来提高沼渣中纤维质的转化效率。【拟解决的关键问题】本研究以沼渣、稻草和猪粪为原料构建了一个原始的沼渣堆肥，通过分离筛选自然堆肥中升温期、高温期以及腐熟期的纤维素降解菌，得到一株能够适用于沼渣堆肥的高效纤维素降解菌，以期为沼气工程中沼渣的堆肥化利用提供优质菌种资源，为沼气工程的可持续发展奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源

样品采集自由沼渣、猪粪和稻草按1.5∶1∶1 比例构建的自然堆肥，堆肥在一个自制的堆肥反应器中进行，外壁贴有泡沫保温材料防止温度散失，在自然堆肥的升温期、高温期和腐熟期采用五点采样法分别采集5个点中深度为10～15 cm的样品，混匀备用。

1.2 培养基

LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，121 ℃灭菌20 min；PCS富集培养基（g/L）：胰蛋白胨5，酵母膏1，NaCl 5，CaCO3，滤纸，秸秆，121 ℃灭菌20 min；纤维素-刚果红培养基（g/L）：CMC-Na 5，（NH4）2SO42，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，NaNO31，蛋白胨0.5，酵母粉0.5，刚果红0.2，琼脂20（固体），121 ℃灭菌20 min；液体产酶培养基（g/L）：NaCl 5，蛋白胨5，酵母膏1，CaCO35，秸秆10，121 ℃灭菌20 min。

1.3 堆肥中纤维素降解菌的筛选

1.3.1 初筛 称取5 g样品加入PCS富集培养基中，在180 r/min，35 ℃条件下震荡培养5～7 d，当观察到滤纸崩解时取5 mL培养液加入新鲜的PCS富集培养基中，在相同条件下培养5～7 d至滤纸崩解，反复3次，取10 mL 培养3 次后的培养液加入90 mL 无菌水中，并逐级稀释至10-3～10-7，取0.1 mL 稀释液涂布至纤维素-刚果红固体培养基上，在37 ℃恒温培养箱中培养3 d，测量菌落直径（d）和透明圈直径（D），根据D/d比值来初步判断各微生物对纤维素的降解能力。

1.3.2 复筛 将初筛得到的菌株在LB 培养基上活化，挑取活化后的菌株按体积分数1%的比例接入灭菌后的LB液体培养基中，35 ℃，180 r/min条件下震荡培养12 h后接入体积分数1%无菌的液体产酶培养基中，在同样的条件下培养7 d 后，取10 mL 发酵液，8 000 r/min 条件下离心10 min 后取上清测定CMC 酶活和滤纸酶活，酶活的测定方案参考文献方法[17]。取1 mL 适度稀释后的粗酶液和1 mL 柠檬酸缓冲液（pH 6.0，0.1 mol/L）加入含有1 cm×6 cm 的滤纸条或含有10 g/L 的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）中，以柠檬酸缓冲液代替粗酶液作为对照，在55 ℃条件下反应60 min 后，立即冷却至室温，加入2 mL DNS 试剂并沸水浴5 min，然后在540 nm 波长下测定吸光值，定义1 mL 粗酶液在1 min 内催化底物生成1 μg葡萄糖为1 个酶活单位（U）。

1.3.3 秸秆降解率研究 将初筛得到的菌株经LB 培养基活化后接种体积分数2%至液体产酶培养基中，35 ℃、180 r/min的条件下培养7 d，用滤纸过滤发酵液，然后用蒸馏水反复冲洗至滤液变为无色，将洗净的秸秆在105 ℃条件下烘干至恒重，计算秸秆失重率，每个处理各做3个重复。

1.4 菌株鉴定

1.4.1 形态学观察 将复筛得到的菌株在LB 培养基上活化后，观察菌落的隆起形状、透明度、颜色、质地、边缘等，挑取少许单菌落经革兰氏染色后置于光学显微镜下观察。

1.4.2 分子生物学鉴定 采用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取供试菌株DNA，利用细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进 行PCR 扩增。PCR 反应体系：细菌基因组DNA 0.5 μL，携有Mg2+的10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，DNA 聚合酶0.2 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，然后加双蒸水至25 μL。PCR条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，55℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，总共30 个循环；72 ℃修复延伸10 min，4 ℃下终止反应。将PCR扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI 上进行比对，使用软件MEGA 6中的Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.5 产酶条件单因素优化

在液体产酶培养基的基础上，采用单因素轮换法依次培养时间（1，2，3，4，5，6，7 d）、初始pH（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5），培养温度（30，35，40，45，50 ℃）和接种量（1%、2%、3%、4%、5%）对菌株F3 产CMC 酶和滤纸酶的影响。每个处理设置3 个重复，发酵液经8 000 r/min 离心10 min 后取上清测定其中的CMC 酶活和滤纸酶活，并测定其中的稻草失重率，其中培养时间的优化不考察失重率。

1.6 响应面优化

在上述单因素优化的基础上，根据Box-Behnken 试验设计原理以CMC 酶活和滤纸酶活为优化目标进行4 因素3 水平响应面优化（表1），并使用理论最优的培养条件进行了3 次重复试验以验证模型的准确性。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Tab.1 Box-Behnken experiment design factors and levels

1.7 分析方法

数据的统计分析使用软件SPSS 22 完成，显著性分析的置信度为95%，数据处理、作图使用软件Origin 9。

2 结果与讨论

2.1 沼渣自然堆肥中纤维素降解菌的分离及筛选

将从自然堆肥中收集的样品经过PCS富集培养基富集后，取培养液稀释涂布在纤维素-刚果红培养基上，共分离出7株具有降解纤维素能力的菌株，通过测量这些菌株在培养基上产生的透明圈大小及菌落大小，计算出各菌株的D/d值，发现7株纤维素降解菌中有2株菌的D/d值大于5。其中标记为F3的菌株D/d、CMC酶活、滤纸酶活以及降解稻草的能力显著高于其他菌株（P＞0.05），因此，后续使用该菌株对产酶条件进行优化。

图1 初筛得到的纤维素降解菌菌落形态Fig.1 Colony morphology of cellulose degrading bacteria

2.2 分离菌株形态学观察和鉴定

2.2.1 菌株形态学观察 如图2 所示，菌株F3 在LB 培养基上的菌落呈乳白色，边缘规则，不透明，菌落表面湿润。革兰氏染色为阳性，菌体呈杆状。

图2 菌株F3菌落形态及革兰氏染色（10×100）Fig.2 Colony morphology and gram stain of strain F3

表2 各菌株的D/d值、关键酶酶活及稻草失重率Tab.2 D/d，key enzyme activity and rice straw weight loss rate of each strain

2.2.2 菌株分子生物学鉴定 16S测序结果表明，该菌株的16S rRNA 全长1 430 bp。从系统进化树中可以看出（图3），该菌株与Alcaligenes faecalisstrain 属的细菌亲缘关系最接近，在NCBI上进行同源性比对，其序列同源性都在97%以上[18]，综合该菌株的菌落形态、分子生物学鉴定结果，菌株F3被鉴定为Alcalig⁃enes faecalisstrain。

图3 基于纤维素降解菌F3 16S rRNA构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on cellulose degrading bacteria F3 16S rRNA

2.3 菌株F3产酶能力及对稻草降解能力条件的初步优化

2.3.1 不同培养时间对菌株F3产酶的影响 随着培养时间的延长，微生物分泌的酶系会在发酵液中积累，在一定的时间内，酶活力通常随着时间的延长而上升，但是过长的培养时间会使已产生的酶活力下降[19]。通常，微生物对纤维素类物质的降解能力通常用CMC 酶活和滤纸酶活（FPase）表示，菌株F3 在不同培养时间的产酶能力如图4 所示，当培养时间为3 d 时，培养液中的滤纸酶活和CMC 酶活均显著（P<0.05）高于其他时间点，分别为（1.34±0.07）U/mL 和（1.96±0.13）U/mL，这表明将F3 在产酶培养基内培养3 d后接种至沼渣堆肥中能够更为迅速的分解其中的纤维类物质进而使堆肥的高温期提前到来。

图4 不同培养时间对菌株F3产酶能力的影响Fig.4 Effect of different culture time on the enzyme production capacity of strain F3

2.3.2 不同初始pH 对菌株F3 产酶及稻草降解能力的影响 pH 通过影响微生物细胞膜表面电荷的性质以及膜的通透性来影响微生物对营养物质的摄取[20]，不同初始pH 对菌株F3 产酶及稻草降解能力的影响如图5 所示，当初始pH 为7.0 时，菌株F3 培养3 d 后的CMC 酶活和滤纸酶活最高，分别为（2.16±0.06）U/mL 和（1.04±0.01）U/mL，并且此时对稻草的降解能力最强，稻草失重率达22.18%。另外，菌株F3 更偏向于在中性的环境中分泌降解纤维物质的酶，但是，当pH 上升至8.5 时，该菌株仍然具有较好的活性，在好氧堆肥中，由于氨的排放，堆体中常为弱碱性状态，因此该菌在沼渣的好氧堆肥中具有较好的应用前景。

图5 不同初始pH条件对F3产酶及稻草降解能力的影响Fig.5 Effect of different initial pH on the enzyme production capacity of strain F3

2.3.3 不同培养温度对菌株F3 产酶及稻草降解能力的影响 温度是影响微生物生长繁殖最重要的因素之一，也是影响酶活力最重要的因素之一[21]。菌株F3 在不同温度下培养的关键酶酶活和稻草的失重率如图6 所示，随着温度的升高，FPase、CMCase 和失重率都呈现先上升后下降的趋势，当培养温度为35 ℃时，三者的值达到最高，分别为（1.08±0.02）U/mL、（1.54±0.07）U/mL、23.35%。随后过高的温度抑制了微生物体内某些活性成分能力，使得微生物产酶能力下降。另外，从图中可知，当温度达到50 ℃时，该菌株仍然具有CMC 和滤纸酶活，并且稻草失重率为10.23%。上述结果表明该菌株具有较为广泛的生长温度，能够适应不同的环境温度。

图6 不同培养温度对F3产酶及稻草降解能力的影响Fig.6 Effect of different culture temperature on the enzyme production capacity of strain F3

2.3.4 不同接种量对菌株F3 产酶及稻草降解能力的影响 不同的接种量对发酵过程中酶活的影响是显著的（图7，P<0.05），低接种量可能会导致延滞期延长，过高的接种量也不会带来更高的酶活，反而可能由于过多的菌量导致系统中溶氧不足，进而降低产酶能力，此外过高的接种量也有可能引入更多的代谢废物，也有可能对酶活力产生一定的抑制作用[22]。如图7 所示，2%的接种量对F3 菌株的产酶是最好的，其FPase、CMCase 和稻草失重率分别为（2.23±0.05）U/mL、（2.55±0.08）U/mL 和24.25%。

图7 不同接种量对F3产酶及稻草降解能力的影响Fig.7 Effect of different inoculum size on the enzyme production capacity of strain F3

表3 各因素水平的处理组合及响应值Tab.3 Treatment combination and response value of each factor level

2.4 响应面优化产酶研究

根据单因素的试验结果，选用温度（A）、pH（B）、培养时间（C）和接种量（D）作为变量，以滤纸酶活和CMC酶活作为优化目标，使用软件Design Expert 8.0.5b对产酶条件进行多元回归拟合，得到CMC（U）=-110.07+1.18A+23.90B+2.63C+3.60D+0.02AB+0.01AC-0.07BC-0.22BD-0.08CD-0.02A2-1.68B2-0.40C2-0.44D2，模型F值为10.07，该拟合的模型达到极显著水平（P<0.001），R2=0.9038，FPA（U）=-90.17+0.89A+20.41B+2.01C+2.10D+0.02AB+0.01AC-0.08BD-0.02CD-0.02A2-1.47B2-0.41C2-0.42D2，模型F值为12.67，该拟合的模型达到极显著水平（P<0.001），R2=0.922 0。两个响应面模型的方差分析如表4 和表5 所示，CMC 模型中pH 和接种量的P值小于0.05，表示pH 和接种量显著影响了CMC 酶的活性，在FPA 模型中，仅有接种量的P值小于0.05，表示接种量对滤纸酶活的影响是显著的。

表4 CMC酶活响应面模型的方差分析Tab.4 Analysis of variance in response surface model of CMCase activity

表5 滤纸酶活响应面模型的方差分析Tab.5 Analysis of variance in response surface model of FPase Activity

从图8 中可以看出，温度、pH、培养时间和接种量均能对CMC 酶活和滤纸酶活产生交互作用，任一条件过高或过低都会对酶活性产生抑制，经模型计算，当温度（A）、pH（B）、培养时间（C）和接种量（D）理论上分别取34.7 ℃、7.08、2.95 d 和2.17%时，能得到最高的CMC 酶活2.73 U/mL；另外，当温度（A）、pH（B）、培养时间（C）和接种量（D）理论上分别取34.56 ℃、7.07、2.94 d 和2.15%时，能得到最高的滤纸酶活2.34 U/mL。由于理论上得到最高的CMC 酶活和滤纸酶活的条件非常接近但是不一致，因此，分别取温度、pH、培养时间和接种量为35 ℃、7.0、3 d 和2%时，经实验验证得到CMC 酶活和滤纸酶活分别为2.63 U/mL 和2.23 U/mL，与模型预测的峰值差距小于5%。上述结果表明，这两个模型可较好地对纤维素降解菌F3 的产酶条件进行优化。

图8 CMC酶活（A）和FPA酶活的响应面图（B）Fig.8 Response surface diagram of CMC enzyme activity（A）and FPA enzyme activity（B）

3 讨论

好氧堆肥因其在发酵过程中能形成高温的环境，有利于沼渣中木质纤维素的降解，但是由于堆肥中的土著微生物数量少，导致自然堆肥效率不高。目前，国内外普遍认为，在堆肥中加入外源微生物菌剂，是促进堆肥快速、高效、完全腐熟的方式之一。然而，由于各种材料的堆肥底物不一，导致针对某种底物的堆肥微生物较少，因此虽已有众多学者对堆肥菌剂进行研究，但各种材料的堆肥微生物菌剂数量仍较为匮乏。目前，大多数对堆肥菌剂的研制都着眼于霉菌，鲜有对细菌菌剂的开发。

景如贤等[23]从土壤中分离出一株芽孢杆菌，经单因素优化后，当培养条件温度为37 ℃，初始pH 为7，接种量为3%及摇床转速为160 r/min 时，该菌株的CMC 酶活为1.465 2 U/mL。诸葛容夏[24]从纸机的腐浆中分离出一株动性微菌属Planomicrobiumsp.WH2-56，在37 ℃条件下以微晶纤维素和秸秆作为底物时，该菌株具有最大的FPA 酶活和CMC 酶活，分别达到0.35 U/mL 和0.62 U/mL。作为堆肥接种剂，通常要在堆肥的起始阶段，即在室温下就能降解堆肥底物，从而起到促进堆肥升温、加速堆肥腐熟的作用。产碱杆菌作为一种废弃物处理常用的微生物，其安全性已得到验证，是一种安全的微生物肥料生产菌[25]。陈晨[26]分离出一株能降解秸秆的产碱杆菌，其CMC 酶活最高，基本稳定在0.022 U。杜冰等[27]通过响应面法优化了菌株Alcaligenes faecalisDL-08 的纤维素酶活力，结果表明，采用优化后的产酶培养基对该菌株进行培养时，能提高该菌株5.6%的纤维素酶活力。本研究通过收集沼渣自然堆肥过程中不同时间的样品，采用梯度稀释法分离出一株高效的纤维素降解细菌，鉴定结果表明该菌为产碱杆菌，经过响应面优化后，在温度、pH、培养时间和接种量分别为35 ℃、7.0、3 d 和2%时，能够得到最高的CMC 酶活2.63 U/mL 和滤纸酶活2.23 U/mL，具有开发成沼渣高效堆肥专用菌剂的潜力。