脂多糖对大黄鱼原代头肾巨噬细胞的激活作用

程安怡, 赵金鹏, 黄小红, 张伟妮,

(1.福建农林大学中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室，福建 福州 350002；2.福建农林大学海洋研究院福建省海洋生物技术重点实验室，福建 福州 350002)

大黄鱼(Larimichthyscrocea)俗称黄花鱼，属鲈形目石首鱼科黄鱼属，是我国养殖产量最高的海水鱼种.据《2021中国渔业统计年鉴》，2020年我国大黄鱼产量为25.4万t.大黄鱼因其体色金黄、寓意吉祥、肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，深受我国等东南亚各国人民的喜爱.然而，随着集约化养殖规模的扩大，疾病问题日益突出，已成为制约大黄鱼养殖产业发展的瓶颈[1].其中，细菌性疾病造成的死亡率占养殖大黄鱼总死亡率的40%[2].革兰氏阴性菌是导致大黄鱼细菌病的主要致病菌，如引起内脏白点病的假单胞菌[3]、引起体表溃疡症的弧菌[4-5]、引起细菌性肠炎病的气单胞菌[6]等.

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的成分之一，是脂质和多糖的复合物，也称内毒素.作为革兰氏阴性菌的主要致病成分之一，LPS可以刺激机体产生免疫应答反应，作为免疫激活剂广泛用于免疫学相关研究[7].

头肾是鱼类的主要免疫器官之一，是巨噬细胞增殖和分化的主要场所.头肾巨噬细胞在鱼类免疫应答的过程中发挥重要作用，参与了对外来病原微生物的识别与吞噬、抗原的处理和递呈、特异性免疫应答的启动等，其细胞活性是鱼体免疫功能的重要评价指标[8].研究表明，LPS具有强免疫原性，能促进鱼类巨噬细胞的活化[9-10].然而，LPS对鱼类巨噬细胞的激活作用机制尚不明确.本研究以大黄鱼原代头肾巨噬细胞(primary head kidney macrophages, PKM)为研究对象，检测LPS对细胞吞噬活性、氮呼吸爆发、促炎因子转录水平及受体[Toll样受体(TLR)、甘露糖受体(MR)、核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体]基因转录水平的影响，明确LPS对大黄鱼PKM的激活作用，有利于进一步研究LPS对大黄鱼PKM的调控机制.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验鱼 试验所用大黄鱼购于福建宁德富发大黄鱼养殖基地，体长(23±5) cm，体重(376±35) g.

1.1.2 主要试剂 LPS购于Sigma公司；Percoll购于GE Healthcare公司；GIBCO Leibovitz′s无酚红L-15培养基、GIBCO胰酶(0.25% EDTA)、PE-荧光微球购于Thermo公司；DAF-FM DA(NO荧光探针)购于碧云天公司；红细胞裂解液购于天根公司；细胞总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、Go Taq®qPCR Master Mix 购于Promega公司.

1.2 方法

1.2.1 大黄鱼PKM的分离和培养 大黄鱼PKM的分离和培养参考本课题组之前的方法[11].将健康的大黄鱼用丁香酚麻醉后剖取头肾，过70 μm细胞筛研磨，细胞悬液经34%/51% Percoll密度梯度离心、贴壁处理，得到大黄鱼PKM，用无酚红的L-15培养基于28 ℃培养备用.

1.2.2 吞噬活性的检测 PKM吞噬活性的检测参考本课题组之前的方法[11].细胞分别用含0、0.01、0.1、1、10和100 μg·mL-1LPS的L-15培养基培养24 h，每个含量设置3个重复.弃去培养基，加入1 μL PE-荧光微球，于28 ℃避光孵育3 h后收集细胞，用AccuriTMC6 Plus流式细胞仪检测.

1.2.3 氮呼吸爆发的检测 PKM氮呼吸爆发的检测参考本课题组之前的方法[11].细胞分别用含0、0.01、0.1、1、10和100 μg·mL-1LPS的L-15培养基培养24 h，每个含量设置3个重复.弃去培养基，加入10 μmol·L-1DAF-FM DA，于28 ℃孵育20 min后收集细胞，用AccuriTMC6 Plus流式细胞仪检测.

1.2.4 免疫相关基因mRNA表达的实时荧光定量PCR检测 PKM经10 μg·mL-1LPS分别处理3、6、12和24 h，同时设立空白对照，每组设3个平行.按照Promega细胞总RNA提取试剂盒的操作说明，在不同处理时间收集细胞提取RNA，用反转录试剂盒反转成cDNA第1链，用Go Taq®qPCR Master Mix 试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，检测LPS对3种促炎因子(IL-1β、IL-6、IL-8)和7种受体基因(TLR1、TLR2、TLR21、MR1、MR2、NOD1、NOD2)mRNA表达量的影响.所用特异性引物如表1所示.以β-actin为内参基因，对实时荧光定量PCR得到各组样品的Ct值作均一化处理，通过2-△△Ct计算各组样品mRNA的相对表达量.

1.3 数据处理

采用SPSS软件对数据进行单因素方差分析，用LSD判定组间的差异性，P<0.01为差异极显著，P<0.05为差异显著.流式细胞仪所测数据用FlowJo软件进行处理.

2 结果与分析

2.1 LPS对大黄鱼PKM吞噬活性的影响

PKM具有吞噬荧光微球的能力.图1a显示，从左往右，第2个峰表示细胞吞噬一个微球，越往右表示其吞噬微球数量越多.用LPS(0.1、1、10、100 μg·mL-1)处理24 h后，与空白对照组相比，峰值明显升高且右移，说明细胞吞噬荧光微球的数量增多.对各组的平均荧光值进行差异性分析，结果(图1b)显示，1、10、100 μg·mL-1LPS处理24 h可以极显著地增强大黄鱼PKM的吞噬能力(P<0.01)，0.1 μg·mL-1LPS处理24 h可以显著增强PKM的吞噬能力(P<0.05)，0.01 μg·mL-1LPS处理24 h的吞噬能力与空白对照组的差异不显著.

表1 实时荧光定量PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

*表示P<0.05，**表示P<0.01.图1 不同含量LPS对大黄鱼PKM吞噬活性的影响Fig.1 Effects of different concentrations of LPS on phagocytic activity of PKM from L.crocea

2.2 LPS对PKM氮呼吸爆发的影响

图2a显示，与空白对照组相比，经1、10、100 μg·mL-1LPS处理24 h后，荧光峰明显右移，说明细胞NO生成量增加.通过对各组的平均荧光值进行差异性分析，结果(图2b)显示：与空白对照组相比，1、10、100 μg·mL-1LPS处理组的平均荧光值极显著升高(P<0.01)；而0.01、0.1 μg·mL-1LPS处理组的平均荧光值与空白对照组的差异不显著.

**表示P<0.01.图2 不同含量LPS对大黄鱼PKM氮呼吸爆发的影响Fig.2 Effects of different concentrations of LPS on nitrogen respiration burst of PKM from L.crocea

2.3 LPS对PKM 3种促炎因子mRNA表达水平的影响

LPS对大黄鱼PKM 3种促炎因子(IL-1β、IL-6、IL-8)mRNA表达水平的影响(图3)显示，用10 μg·mL-1LPS处理大黄鱼PKM后，IL-1β、IL-6和IL-8的表达水平在3、6、12和24 h均极显著上调(P<0.01).

**表示P<0.01.图3 LPS对大黄鱼PKM 3种促炎因子mRNA表达水平的影响Fig.3 Effects of LPS on mRNA expression of 3 pro-inflammatory cytokines in PKM from L.crocea

2.4 LPS对PKM 3种Toll样受体mRNA表达水平的影响

LPS对PKM 3种Toll样受体(TLR1、TLR2、TLR21)mRNA表达水平的影响(图4)显示：用10 μg·mL-1LPS处理后，大黄鱼PKMTLR1 mRNA的表达水平在24 h极显著上调(P<0.01)，在12 h显著上调(P<0.05)，在6 h无显著变化；TLR2 mRNA的表达水平在6、12和24 h极显著上调(P<0.01)；TLR21的表达水平在3 h无显著变化，在6、12和24 h极显著上调(P<0.01).

*表示P<0.05，**表示P<0.01.图4 LPS对大黄鱼PKM 3种Toll样受体 mRNA表达水平的影响Fig.4 Effects of LPS on mRNA expression of 3 Toll-like receptors in PKM from L.crocea

2.5 LPS对PKM 2种甘露糖受体mRNA表达水平的影响

图5显示：用10 μg·mL-1LPS处理后，PKM甘露糖受体MR1 mRNA的表达水平在3、6、12和24 h均极显著下调(P<0.01)；甘露糖受体MR2 mRNA的表达水平在3、6、12和24 h均极显著上调(P<0.01).

**表示P<0.01.图5 LPS对大黄鱼PKM 2种甘露糖受体mRNA表达水平的影响Fig.5 Effects of LPS on mRNA expression of 2 mannose receptors in PKM from L.crocea

2.6 LPS对PKM 2种NOD样受体mRNA表达水平的影响

图6显示，用10 μg·mL-1LPS处理大黄鱼PKM后，2种NOD样受体NOD1和NOD2 mRNA的表达水平在3、6、12和24 h均极显著上调(P<0.01).

**表示P<0.01.图6 LPS对大黄鱼PKM 2种NOD样受体mRNA表达水平的影响Fig.6 Effects of LPS on mRNA expression of 2 NOD receptors in PKM from L.crocea

3 讨论

巨噬细胞在鱼类免疫应答的过程中发挥着重要的功能.通常情况下，鱼体中的巨噬细胞处于相对静止的状态，吞噬活性和需氧代谢都很低，仅具有一定的非特异性吞噬和趋化能力.当巨噬细胞被激活后，通过经典或替代途径分化成M1或M2型巨噬细胞[12].M1型巨噬细胞的典型标志是吞噬能力增强、大量合成促炎因子、产生NO和O2-等反应氧族，主要参与病原的清除和炎症反应的启动[13]；相反，M2型巨噬细胞能分泌抗炎因子和精氨酸酶等，减少NO生成，修复细胞因炎症反应带来的损伤，利于组织修复[14].本研究结果显示，LPS能够增强大黄鱼PKM的吞噬能力，提高NO的生成量，上调3种促炎因子基因(IL-1β、IL-6、IL-8)的表达水平，说明LPS可以激活大黄鱼PKM，并刺激其向M1型巨噬细胞分化.这与在人原代外周血巨噬细胞[15]、小鼠原代腹腔和肠道巨噬细胞[16]、小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7[17]及鸡巨噬细胞HD11[18]中的结果是一致的.IL-1β、IL-6和IL-8是巨噬细胞产生的3种主要促炎因子.在炎症反应中，IL-1β可以活化T细胞并促进其增殖分化，IL-6可以促进B细胞增殖分化、产生抗体，而IL-8主要起到趋化中性粒细胞和T细胞的作用[19].本研究中随着LPS刺激时间的延长，IL-8 mRNA表达量的升高最明显，说明其趋化作用逐渐增强，促使炎症反应加剧.

Toll样受体是机体天然免疫系统的重要组成部分，能识别多种病原体相关分子模式.位于革兰氏阴性菌外膜上的LPS，能够与宿主细胞表面Toll样受体结合从而诱导细胞产生免疫应答[20].在哺乳动物中，已证实TLR4是LPS的主要识别受体[21]，LPS可被TLR4识别诱导腹腔巨噬细胞的活化，产生 IL-1β、IL-6、TNF-α和NO[22].然而在鱼类中，仅有少数鲤科鱼类存在TLR4，且已证实其对LPS刺激不响应[23].

TLR1和TLR2都属于TLR1亚家族，分布在细胞膜上，主要识别革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和病毒；TLR21属于TLR11亚家族，也分布在细胞膜上，能够广泛识别RNA和DNA病毒以及侵染的细菌，在非特异性免疫中发挥重要作用[24].秦勤等[25]研究表明，LPS刺激48 h后可以提高人角膜上皮细胞中TLR1和TLR2基因的表达量；王梁华等[15]研究表明，TLR2抗体可以抑制LPS对巨噬细胞吞噬能力的激活，证明TLR2参与了细胞对LPS的识别；冯伟科等[26]研究表明，LPS能诱导鼠源巨噬细胞RAW264.7 TLR2 mRNA表达量的上调；盛金良等[20]研究表明，在LPS刺激后，绵羊肺泡巨噬细胞TLR2 mRNA在12 h的表达水平最高.在本研究中，LPS刺激6 h后开始能够极显著上调大黄鱼PKMTLR2和TLR21 mRNA的表达量，刺激12 h后能够显著上调TLR1 mRNA的表达量.不同的TLR成员识别不同的特异性配体，目前尚无鱼类TLR与LPS识别的直接证据.本研究结果显示，大黄鱼PKMTLR1、TLR2和TLR21对LPS刺激均有响应，其中，TLR21响应程度最强，然而其是否直接参与了细胞对LPS的识别还需要进一步证实.

甘露糖受体是一种跨膜糖蛋白，属于C型凝集素家族，在巨噬细胞和树突状细胞等多种免疫细胞上均存在[27-28].甘露糖受体是吞噬细胞重要的模式识别受体和内吞受体，可以识别多种内源性和外源性的糖分子[29].已有研究表明，巨噬细胞能通过甘露糖受体的C型凝集素样结构域(CTLD)识别LPS，从而介导对病原菌的清除[30].本研究结果显示：大黄鱼PKMMR1和MR2对LPS刺激均有响应，但变化趋势不同；LPS能够显著上调MR2的表达，下调MR1的表达，揭示了2种甘露糖受体在LPS识别过程中行使着不同的功能.

NOD1和NOD2都是NOD样受体家族的成员，在细菌识别和激活免疫反应中起着至关重要的作用[31].NOD2主要在骨髓细胞、单细胞、巨噬细胞和树突状细胞中表达；NOD1的分布更广泛，上皮细胞中也有表达[32].在鱼类中，NOD1能响应革兰氏阴性菌的感染，并可能在细菌成分的鉴定中发挥重要作用.NOD1可以识别LPS，通过受体相互作用丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)激活NF-κB信号通路，进而促进炎性细胞因子的表达，诱导机体对细菌感染的反应.LPS可以通过与鮸鱼(Miichthysmiiuy)巨噬细胞NOD1结合并激活NF-κB发挥调节巨噬细胞的功能，上调TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的表达[33].本研究结果表明，大黄鱼PKMNOD1和NOD2均对LPS的刺激有响应.

4 结论

本研究结果表明，LPS可以显著提高大黄鱼PKM的吞噬活性和NO生成量，上调细胞IL-1β、IL-6和IL-8等3种促炎因子基因的表达，对大黄鱼PKM有明显的激活作用，并刺激其向M1型巨噬细胞分化.此外，TLR1、TLR2、TLR21、MR2、NOD1和NOD2对LPS刺激均有响应，鱼类巨噬细胞识别LPS的关键受体还有待进一步研究.