HPLC-MS/MS法同时测定杞菊地黄丸(浓缩丸)中11种成分的含量

邓俊杰，谢浙裕*，何丽娜

(1.绍兴市食品药品检验研究院，绍兴 312000；2.浙江大学第一附属医院临床医学部，杭州 310000)

杞菊地黄丸(浓缩丸)现行标准为2020年版《中国药典》一部,处方由枸杞、菊花、熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻8味中药制成，具有滋肾养肝的功效。用于治疗肝肾阴亏、眩晕耳鸣、羞明畏光、迎风流泪、视物昏花[1-2]。与传统剂型相比，浓缩丸具有服用量少、方便携带等优点。中成药的功效是多种活性成分共同作用的结果，但查阅《中国药典》和相关文献[3-7]，仅有高效液相色谱(HPLC)法测定酒萸肉中莫诺苷、马钱苷和牡丹皮中丹皮酚含量的报道，缺少其余6味中药的质量控制指标，不能全面评价其整体质量。

根据2020年版《中国药典》和相关文献报道[8-11]，枸杞的指标成分为甜菜碱；菊花的指标成分为绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸；熟地黄的指标成分为毛蕊花糖苷；山药的指标成分为尿囊素；茯苓的指标成分为茯苓酸；泽泻的指标成分为23-乙酰泽泻醇B。

本实验使用高效液相色谱-三重四级杆串联质谱(HPLC-MS/MS)法，以多反应监测模式进行检测，正负离子同时扫描，具有质谱灵敏度高、准确性好、选择性强的特点，建立了同时测定杞菊地黄丸(浓缩丸)中11种有效成分的方法。既简化了甜菜碱的提取方式，又解决了多成分液相检测时周期长、杂质干扰大的问题，对8味中药的各指标成分进行了含量测定，为杞菊地黄丸(浓缩丸)的质量标准制定提供了依据[12-16]。

1 仪器与试药

1.1仪器 1260-6470型高效液相-三重四级杆串联质谱仪(美国Agilent公司)；XPE26百万分之一电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；ZM-200型超离心碾磨仪(德国Retsch公司)；FESCO17型微量离心机(美国Thermo Fisher公司)；HH-4A型数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)。

1.2试药 甜菜碱(批号110894-201604，质量分数为99.2%)，绿原酸(批号110753-202018，质量分数为96.1%)，木犀草苷(批号111720-201810，质量分数为93.5%)，3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸(批号111782-201807，质量分数为94.3%)，毛蕊花糖苷(批号111530-201914，质量分数为95.2%)，莫诺苷(批号111998-201703，质量分数为97.4%)，马钱苷(批号111640-201808，质量分数为99.0%)，丹皮酚(批号110708-201908，质量分数为99.8%)，尿囊素(批号111501-200202，质量分数为100.0%)，23-乙酰泽泻醇B(批号111846-201705，质量分数为99.7%)，均购自中国食品药品检定研究院；茯苓酸(批号J2140009，质量分数为100.0%,ANPEL公司)；甲醇和乙腈均为质谱纯，均购自Merck公司；甲酸(质谱纯，CNW公司)；杞菊地黄丸(浓缩丸)(仲景宛西制药股份有限公司，批号：200511、200416、190806、190417)。

2 方法与结果

2.1液相色谱-质谱条件

2.1.1色谱条件 色谱柱：Agilent Porshell EC-C18(50 mm×4.6 mm，2.7 μm)柱；流动相：乙腈-1 mL·L-1甲酸(梯度洗脱，见表1)，柱温：30 ℃，流速：0.5 mL·min-1，进样量：2 μL。

表1 梯度洗脱方法

2.1.2质谱条件 离子源：电喷雾离子源；干燥气和碰撞气：氮气(质量分数≥99.999%)；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：6 L·min-1；扫描模式：正负离子同时扫描；毛细管电压：4 000 V(+)，3 500 V(-)；为提高检测灵敏度，采用分时间段的多反应监测(MRM)模式，电离模式、保留时间、定量离子对、碎裂电压和碰撞能量(CE)，见表2。

表2 11种成分的电离模式、保留时间、定量离子对、碎裂电压和碰撞能量

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液 称取甜菜碱20.18 mg、绿原酸10.86 mg、木犀草苷10.98 mg、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸15.28 mg、毛蕊花糖苷15.79 mg、尿囊素10.12 mg、茯苓酸10.83 mg、23-乙酰泽泻醇B 15.65 mg，置于同一100 mL量瓶中，加入体积分数为70%的甲醇制得①号储备液；分别称取莫诺苷10.73 mg、马钱苷20.07 mg、丹皮酚25.95 mg，置于同一25 mL量瓶中，加入体积分数为70%的甲醇制得②号储备液。再精密量取①、②号储备液各2 mL，置于同一20 mL量瓶中，加入体积分数为70%的甲醇制成混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液 取本品适量(批号200511)，研细，取2.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70%的甲醇50 mL，密塞，称定质量，加热回流1 h，取出，放冷，再称定质量，用体积分数为70%的甲醇补足减失的质量，摇匀，超高速离心，取上清液作为供试品溶液。

2.2.3阴性供试品溶液 按照处方组成及生产工艺制得缺枸杞、菊花、熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓和泽泻的阴性供试品，按照2.2.2项下方法制得阴性供试品溶液。

2.3方法学验证

2.3.1专属性考察 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液各2 μL，按照2.1项下色谱条件检测，记录质谱图。结果供试品显示出与对照品保留时间相同的质谱峰，阴性供试品溶液在此保留时间无质谱峰，其他组分对结果无干扰，表明该方法系统适用性良好。见图1。

图1 11种成分的提取离子流图

2.3.2线性关系考察 精密量取2.2.1项下制备的①、②号对照品储备液各2 mL，分别置于同一5、10、20、50、100 mL量瓶中，加体积分数为70%的甲醇稀释至刻度，制得系列混合对照品溶液。按照2.1项下色谱条件测定，以质量浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，计算得线性回归方程，结果11种成分在各自质量浓度范围内均呈良好线性关系。见表3。

2.3.3定量限 精密度量取2.2.1项下制备的混合对照品溶液，逐级稀释，按照2.1项下色谱条件测定，以信噪比为10∶1对应的质量浓度为定量限下限，结果见表3。

表3 11种成分的回归方程、线性范围、检测限和定量限

2.3.4精密度实验 精密量取2.2.1项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，结果甜菜碱、绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、毛蕊花糖苷、莫诺苷、马钱苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰泽泻醇B峰面积的RSD值分别为0.5%、0.7%、0.4%、0.9%、1.6%、0.8%、1.2%、0.9%、1.0%、1.4%、1.7%，表明仪器精密度良好。

2.3.5重复性实验 取6份同一样品粉末，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定，结果甜菜碱、绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、毛蕊花糖苷、莫诺苷、马钱苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰泽泻醇B峰面积的RSD值分别为0.7%、0.3%、0.5%、1.1%、1.7%、0.9%、1.9%、0.7%、1.5%、2.1%、1.3 %，表明该方法重复性良好。

2.3.6稳定性实验 取同一供试品溶液，分别在0、4、8、12、24、48 h，按照2.1项下色谱条件测定，结果甜菜碱、绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、毛蕊花糖苷、莫诺苷、马钱苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰泽泻醇B峰面积的RSD值分别为0.8%、0.7%、0.6%、1.4%、1.9%、0.7%、1.5%、1.2%、1.0%、1.7%、1.5%，表明稳定性良好。

2.3.7加样回收率实验 精密称取9份同一样品粉末(批号200511)，每份1.0 g，分别置于具塞锥形瓶中，3份为1组，分别加入相当于1.0 g样品中各组分含量为80%、100%、120%的对照品，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定得甜菜碱、绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、毛蕊花糖苷、莫诺苷、马钱苷、丹皮酚、尿囊素、茯苓酸和23-乙酰泽泻醇B的平均回收率分别为97.66%、97.32%、97.88%、97.67%、98.35%、97.52%、98.34%、98.41%、98.03%、97.81%、98.19%，RSD值分别为0.5%、1.2%、0.8%、0.5%、0.5%、0.9%、0.3%、0.5%、0.4%、0.6%、1.0%，表明该方法准确、可靠。

2.4样品测定 精密称定4批样品粉末各2.0 g，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各2 μL，按照2.1项下色谱条件测定，计算各成分含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果 (n=4)

3 讨论

3.1检测器的选择 HPLC法同时检测11种成分，存在前处理复杂、基线分离难、最大吸收波长不同等问题，而质谱法具有灵敏度高、准确性好、选择性强、线性范围宽的特点。此外，以多反应监测模式进行含量测定，同时扫描正负离子对，相较于紫外检测器，检验的时间更短，结果更准确。

3.2监测离子对的选择 质谱多反应监测模式以特征离子为目标，选择合适的母离子和子离子是检测的关键。本实验先以全扫描模式确定母离子，再优化碎裂能量和碰撞能量，确定信号响应最强的子离子，最终为11种成分各确定1对定量离子。

3.3流动相的选择 分别比较了乙腈-水、乙腈-1 mL·L-1甲酸、甲醇-水、甲醇-1 mL·L-1甲酸作为流动相的检测结果，发现乙腈和甲醇均能达到较好的分离效果，并且乙腈较甲醇具有更强的洗脱能力和更低的洗脱压力。少量甲酸的加入既改善了峰形，又提高了响应，因此，最终选用乙腈-1 mL·L-1甲酸作为流动相。

3.4提取溶剂的选择 由于有效成分多为酚酸和皂苷类化合物，二者在水和甲醇中溶解度高，比较甲醇、体积分数为70%的甲醇、体积分数为50%的甲醇的提取效果，发现体积分数为70%的甲醇的提取效果最好，干扰较少，最终选用体积分数为70%的甲醇作为提取溶剂。

3.5提取方法的选择 比较超声和回流2种提取方法，结果显示，在相同提取时间下，回流提取液的含量高于超声提取液，最终选用回流提取法。

3.6提取时间的选择 比较回流提取30、60、90 min的结果，发现提取60 min时，各成分含量基本一致，最终选用提取时间为60 min。

根据上述实验结果，本方法具有前处理简便、分析时间短、结果准确、检测成分多等特点，可为杞菊地黄丸的质量控制提供参考。