泡菜细菌多样性和风味成分研究进展

汪冬冬，唐垚，伍亚龙，张伟，陈功,3，张文学，张其圣,3*

1(四川大学 轻工科学与工程学院，四川 成都，610065)2(四川东坡中国泡菜产业技术研究院，四川 眉山，620000) 3(四川省食品发酵工业研究设计院有限公司，四川 成都，611130)

泡菜作为我国传统发酵食品的典型代表，受原料、区域、工艺、文化等因素影响，泡菜遍布我国大江南北，形成了一批特色地方产业，如四川泡菜、涪陵榨菜和东北酸菜等。泡菜发酵伴随着一系列复杂理化和生物反应，赋予了泡菜产品独特的风味，增加了泡菜的营养价值，延长了保质期，泡菜深受消费者喜爱[1]。

泡菜传承千年，有些传统工艺正在逐渐消失，了解泡菜微生物和风味特征是保护、创新传统泡菜的重要内容。微生物是泡菜的核心，泡菜的发酵是多种微生物之间相互作用的结果，由于基质、工艺、环境和微生物互作等影响，泡菜菌群结构复杂，不同种类的微生物扮演不同的角色，其中以乳酸菌作为主导微生物。乳酸菌在泡菜发酵过程中将碳水化合物发酵成乳酸、乙酸等，快速酸化食物基质，从而提高泡菜货架期和微生物安全性。此外，大多数乳酸菌具有促进发酵食品风味形成的能力。风味作为评价产品品质最重要的指标之一，其形成过程非常复杂，有必要探究其形成机理及分布。为此，本文将重点介绍不同工艺泡菜细菌多样性、风味分布及其表征手段，从原料和微生物种类分析泡菜风味形成机理，阐述核心微生物在泡菜中对风味形成和风味产生途径的作用。

1 泡菜细菌多样性研究

泡菜的发酵方式多以自然发酵为主，在盐水浸泡环境中，附着在蔬菜表面的多种微生物利用原料中的糖类等营养物质迅速繁殖。泡菜发酵过程中呈现以乳酸菌为主导的微生物系统，同时伴有酵母菌、醋酸菌和肠杆菌，被污染的泡菜还有少量霉菌。泡菜微生物的演变如图1所示，来自原料中的微生物经过栏栅因子(食盐、有机酸、pH等)的作用，大量不适宜微生物被抑制或降解，这其中包括大部分的腐败菌，多样性降低，泡菜体系下微生物出现“自我净化”。大量研究表明细菌是泡菜发酵过程中的主导微生物，细菌发酵过程中优势菌群一般认为是乳酸菌，包括植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevi)等[2]。

图1 泡菜成熟过程微生物菌群演变模型Fig.1 Evolution model of microbial flora in the process of Paocai maturation

随着分子微生物学技术的快速发展，采用传统菌落形态、生化鉴定与分子鉴定(如16S rDNA、28S rDNA)相结合的技术手段被广泛应用于泡菜微生物的研究。近年来PCR-DGGE、克隆文库、第二代高通量测序、宏基因组等免培养方法发现了大量不可培养微生物。

泡菜发酵过程中伴随着微生物的演变。泡菜中微生物主要来自蔬菜原辅料，常报道新鲜蔬菜表面含有腐败菌，如假单胞菌属(Pseudomons)、肠杆菌属(Enterobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、成团泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和拉乌尔菌(Raoultella)等[3]。PEDERSON[4]研究卷芯白菜时，首次指出了L.mesenteroides启动泡菜发酵。JEONG等[5]采用454焦磷酸测序技术研究泡萝卜发现发酵初始阶段以Leuconostoc、Lactobacillus、Pseudomonas、Pantoea和Weissella为主，其中Leuconostoc在发酵3 d后一直到结束都是优势细菌。LEE等[6]采用454焦磷酸测序技术指出家庭制作的中国泡白菜在发酵前期Weissella、Lactobacillus等占优势，发酵末期以Lactococcus、Weissella和Lactobacillus为主导菌。XIONG等[7]采用可培养方法研究自然发酵泡菜发现初始阶段以粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubsp.lactis)为主导，发酵中期以肠膜明串珠球菌肠膜亚种(L.mesenteroidessubsp.mesenteroides)为优势菌，发酵末期以L.plantarum和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)为主导细菌。JUNG等[8]采用宏基因测序的方法发现韩国泡菜发酵初期以Leuconostoc为主，随后Lactobacillus和Weissella快速增加成中期的主导细菌，发酵后期以Leuconostoc、Lactobacillus和Weissella为主。

发酵成熟后不同工艺泡菜细菌菌群结构存在一定差异。四川泡菜以Lactobacillus为主，主要有戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)、L.plantarum、L.brevis，特点是耐酸性强。榨菜主要以盐单胞菌属(Halomonas)、片球菌属(Pediococcus)、Lactobacillus为主，种水平代表性菌种有冰下盐单胞菌(Halomonassubglaciescola)、阿根廷片球菌(Pediococcusargentinicus)、L.brevis等。酸菜主要以Lactococcus、芽孢杆菌(Bacillus)、Lactobacillus为主，代表性菌种有L.plantarum、棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)、弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)、清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)、L.brevi等。韩国泡菜主要以Weissella、Lactobacillus、Leuconostoc为主，代表性菌种有L.mesenteroides、L.sakei、高丽魏斯氏菌(Weissellakoreensis)等。

2 泡菜风味研究进展

2.1 泡菜风味形成机理

风味是评价食品质量的重要指标，也是泡菜新工艺、新产品开发的重要衡量指标。风味物质包括醇、酯、醛、酮类和硫化合物等挥发性成分，赋予泡菜香气，也包括有机酸、氨基酸、还原糖、核苷酸和多肽等非挥发性滋味物质，赋予甜、酸、苦、咸和鲜味等。风味物质的生成与微生物群落代谢相关，由微生物菌群及其产生的酶类分解、代谢泡菜中的糖、脂肪和蛋白质等一系列生物化学过程而形成[9]。泡菜风味形成模型如图2所示，来自原料表面的初始微生物相互竞争，利用原料中的碳水化合物等营养物质生长代谢，随着乳酸菌的生长，其代谢产生乳酸和乙酸等，使环境中总酸增加，pH降低，耐受性差的微生物逐渐被淘汰，发酵后期以耐性强的乳酸菌主导发酵。这个过程中原料中的糖类、蛋白质等被降解，产生有机酸、氨基酸等风味成分。

图2 泡菜成熟过程风味形成机理Fig.2 The formation mechanism of flavor during the ripening process of Paocai

泡菜的风味一部分来自于蔬菜和香辛料等原辅料，另一部分来自于发酵过程中的生理、生化反应和微生物的作用：

(1)蔬菜原辅料中的滋味物质和香气物质：风味成分直接在植物生长中合成，许多蔬菜、香辛料香气成分都是由生物合成产生，这也是蔬菜、辅料等固有的滋味和香气成分，其中滋味成分包括有机酸、游离呈味氨基酸、核苷酸、糖、无机盐和芥子苷等，它们沸点较高，不易挥发，如蔬菜中的草酸、柠檬酸和苹果酸等。原料中香气多来源于丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸亮氨酸和甲硫氨酸等的衍生物。蔬菜原料中的3-甲基正丁醛、3-甲基丁醇、3-甲基正丁酸来源于亮氨酸，苯乙醛、苯乙醇来源于苯丙氨酸[10]。香气成分包括醇类、酮类、酯类、醛类、萜烯等，在泡菜发酵过程中很多都会被保留下来，赋予特有的香气，还能抑制杂菌的生长，除去发酵过程中产生的异味等。泡菜原料中常见的青菜、萝卜等十字花科蔬菜中含有芥子苷，在芥子酶的作用下会被分解为异硫氰酸酯、二甲基三硫醚等，从而使原料具有辛辣味、刺激味和芳香味[11]。

(2)微生物发酵产生的滋味和香气物质：泡菜发酵过程中主要以乳酸菌为主，发酵前期还有少量醋酸菌、大肠杆菌和酵母菌等。乳酸菌是主要风味产生菌，乳酸菌产生的酶类可将多种食品成分(包括碳水化合物、蛋白质和脂质)水解为风味前体物，并将其转化为香气化合物。乳酸菌3个关键代谢途径涉及挥发性化合物的产生：碳水化合物代谢、蛋白水解与氨基酸分解代谢、脂肪分解与脂肪酸代谢，其中最主要的代谢作用是将碳水化合物发酵产生乳酸，即食品的酸化作用，同时乳酸菌也产生有机酸、多元醇等，为风味物质转化提供了前体物质。

乳酸菌与糖类发酵偶联的底物水平磷酸化，产生的能量物质ATP被用于生物合成。乳酸菌对糖类物质代谢途径主要有同型发酵和异型发酵(包含双歧途径)，代谢产物因底物、乳酸菌物种和环境条件而有所不同。同型发酵乳酸菌包括Pediococcus、Lactococcus、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)和一些乳杆菌(如：德氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、弯曲乳杆菌等)，六碳糖通过糖酵解途径、五碳糖通过磷酸戊糖途径来完成代谢，产生丙酮酸，随后丙酮酸被还原为乳酸[12]。异性发酵乳酸菌包括Weissella、Leuconostoc、酒球菌属(Oenococcus)和部分Lactobacillus[如：L.brevis、发酵乳杆菌(L.fermentum)等]，糖类物质通过6-磷酸葡萄糖酸/磷酸酮糖途径发酵糖类，葡萄糖在葡萄糖激酶下产生6-磷酸葡萄糖酸，再由6-磷酶的作用下水解为多肽和氨基酸，氨基酸呈酸、甜、苦味特征，也是风味的前体物质。从游离氨基酸到挥发性化合物的转化主要涉及2个途径：氨基酸裂解酶催化的降解反应和由氨基酸氨基转移酶引发的途径，酪氨酸经降解得到苯酚，色氨酸转化为吲哚，蛋氨酸降解为甲硫醇。碳-硫裂解酶的作用下释放出硫醇，硫醇进一步氧化为含硫化合物，大部分硫化物阈值较低，含有大蒜、白菜和煮沸的马铃薯气味[13]。氨基酸经转氨酶催化脱氨或转氨后形成α-酮酸，α-酮酸进一步脱羧，经过缩合、氧化或酯化，最后形成醛、酸、醇和酯等风味物质[14]。

蔬菜中含有少量脂肪酸，而脂肪酸的水解和氧化是风味化合物的主要来源，脂质(例如甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯)在脂肪酶的作用下水解释放出游离脂肪酸，而游离脂肪酸是大多数发酵食品中的重要香气化合物，Lactococcus和Lactobacillus中含有较高的脂肪酶[15]。短链和中链游离脂肪酸(碳链中碳原子<12)阈值低，具有特征性的风味。如丁酸具有腐臭和刺激性的风味；己酸具有刺鼻的风味；辛酸具有霉味、腐臭和果味等。长链游离脂肪酸(碳链中碳原子>12)阈值高，对风味的影响较小[16]。蔬菜中含不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸，是分解代谢反应的前体物质，通过氧化产生甲基酮、酯、仲醇和内酯等风味物质。不饱和脂肪酸氧化有2个途径，其一是在自由基存在下不饱和脂肪酸通过β-氧化形成氢过氧化物，另一种途径可形成4-或5-羟基酸，然后将其转化为γ-或δ-内酯，具有强烈的果香味。饱和脂肪酸通过β-氧化作用使β-酮酸脱羧而生成奇数碳甲基酮，而甲基酮可以被还原酶还原为仲醇[17]。此外，乳酸菌具有许多酯酶，甘油酯和醇中可以通过醇解反应直接合成香料酯。例如，乳酸菌可以用丁酸和己酸使乙醇酯化，生成丁酸乙酯和己酸乙酯[18]。

此外，泡菜体系的酵母菌消耗糖类物质产生乙醇，醋酸菌在发酵前期产生醋酸，具有较强的刺激性，并赋予酸味和香气，促进食欲的作用。泡菜未成熟前或被污染时，常出现大肠杆菌、葡萄球菌和假单胞菌等影响风味[19]，其中大肠杆菌可以分解葡萄糖为乳酸、乙酸、琥珀酸、乙醇等物质，但该菌群往往随着乳酸菌的生长而被抑制[20]。

所以，泡菜的风味与原料和发酵条件有关，原料中固有的风味成分和发酵产生的风味及合成的风味成分混合协调，不同的种类和含量都会产生不同的效果，从而呈现独特的风味。

2.2 泡菜风味研究手段

泡菜风味研究聚焦在有机酸、氨基酸、糖类和挥发性风味成分等，研究手段包括分子感官组学、蛋白组学、代谢组学等，氨基酸的研究大多采用高效液相色谱仪和氨基酸自动分析仪进行分析，也有采用烷基化进行气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析。有机酸采用气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)和离子交换色谱法分析。韩国研究学者采用核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)对韩国泡菜中滋味物质进行研究，但只能进行相对定量[21]。滋味成分研究常常结合电子舌和感官评定进行综合分析。挥发性风味物质研究包括香气组分的提取、定性定量、重要风味化合物的判定和关键风味物质的确定。提取方法有同时蒸馏萃取(simultaneous distillation extraction, SDE)、固相微萃取(solid phase microextraction, SPME)、搅拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction, SBSE)、溶剂辅助风味蒸发法(solvent-assisted flavor evaporation, SAFE)、动态顶空取样(dynamic headspace, DHS)和超临界流体萃取(supercritical fluid extraction, SFE)等[22]，但目前风味的提取和测定的研究还没有统一的标准，每种方法都有优缺点，使用前需要考虑方法局限性。鉴定方法有紫外光谱技术(ultraviolet, UV)、红外光谱技术(infrared spectroscopy, IR)、GC-MS、气相色谱-离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)、全二维气相色谱与飞行时间质谱联用(comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry, GC×GC-TOFMS)等[23]，采用质谱库比对法、标准品比对法、保留指数定性法等。香气物质定量可采用面积/峰高百分比定量法、归一化法、外标定量法和内标定量法等。由于工艺、原料等影响，经过自然发酵后，泡菜风味化合物较多，不同的香气物质对泡菜的香气特征有不同的贡献。目前判定食品中的重要贡献香气化合物的方法有：香气萃取稀释分析(aroma extract dilution analysis, AEDA)和时间-强度法(odor-specific magnitude estimation, OSME 技术)。AEDA方法是将萃取浓缩后的提取成分与溶剂进行梯度稀释后利用气相色谱-嗅闻联用法(gas chromatography olfactometry, GC-O)进行闻香，确定初始浓度以及稀释度最大时的物质浓度的比值，即FD值。OSME技术是将萃取浓缩得到的香气样品直接进行GC-O闻香，其结果以香气强度表示。通常使用气味活力值(odor activity value, OAV)的大小来表征香气成分在特定食品基质中贡献度，OAV越大表示化合物的香气贡献越大。初步判定食品中重要香气化合物后还需要对结果进行进一步的验证，目前采用的主要研究方法包括香气重构、香气缺失和香气添加试验，根据香气化合物添加在模拟液中的风味特征与食品初始风味的相似性来确定该香气化合物对食品风味整体的重要程度。

2.3 泡菜风味成分

泡菜中有机酸是酸味的主要来源，包含乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、草酸、甲酸和丁酸等，其中乳酸和乙酸是泡菜中主要有机酸，对泡菜风味和保藏起着重要的作用。乳酸的酸味柔和，有后酸味，是同型和异性发酵乳酸菌的代谢产物，其含量决定了泡菜的成熟度。乙酸是发酵初期的醋酸菌和异型乳酸菌代谢产生，乙酸有较强的刺激味，有强化食欲的功能，能与醇类产生乙酸乙酯等香味物质，对泡菜风味具有促进作用[24]。苹果酸、柠檬酸、草酸等来源于蔬菜原料，柠檬酸在泡制发酵过程中经乳酸菌等微生物利用产生乳酸、乙酸、乙偶姻、2,3-丁二醇和双乙酰等。甲酸和丁酸是腐败微生物代谢产生的刺激性气味，常出现在发酵后期。

泡菜中有门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸和丙氨酸等30多种氨基酸[21]。KATO等[25]将17种氨基酸分为4类，包括鲜酸味(门冬氨酸和谷氨酸)、甜味(丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸)、苦味(精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸和赖氨酸)、无味(胱氨酸和酪氨酸)。泡菜成熟时，甜味氨基酸以甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸为主，含有高含量的苦味氨基酸，主要为脯氨酸和精氨酸，但受阈值的影响，苦味的呈味效果也可能会受到氯化钠和酸的抑制[26]，谷氨酸和氯化钠结合会增强泡菜的鲜味[27]，所以泡菜的主导滋味是咸味和鲜味。氨基酸还作为风味前体物和其他化合物反应生成风味物质，例如氨基酸与戊糖或甲基戊糖的还原产物4-羟基戊烯醛作用生成含有氨基的烯醛类香气物质[28]。

泡菜中常见挥发性成分有乙酸、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、芳樟醇、异硫氰酸烯丙酯、苯乙醇等，但受微生物、工艺、原料等影响，风味差异较大。章献等[29]采用气质联用技术从2种韩国泡菜中分离出34种共同的挥发性成分，包括乙醇、乙酸、烯类和硫醚类等物质。ZHAO等[30]研究传统泡菜发现乙酸、丙酸、乙酸乙酯、丙酸乙酯、水杨酸甲酯、甲硫醇、二硫化碳、硫羟乙酸甲酯、二甲基二硫醚和二甲基三硫醚等为主要挥发性成分。JANG等[31]采用GC-MS发现韩国泡萝卜中二烯丙基硫醚、二甲基二硫、烯丙基甲基硫醚和甲基丙基二硫醚为主要挥发性成分。YAO等[32]采用GC-MS结合电子鼻发现柠檬烯、苯乙醇、苯甲醛、壬醛和异硫氰酸烯丙酯为冬菜不同发酵期中共同的挥发性成分。KANG等[33]研究发现韩国泡菜的主要风味物质为二甲基二硫醚和二甲基三硫醚等含硫化合物。虽然目前泡菜风味成分较多，但相关研究还缺乏系统性，挥发性成分在泡菜基质中的香气特征、香气贡献度等还未知，有关重要风味化合物和关键风味物质的判定远达不到白酒、茶、酸奶等研究水平，这将是泡菜风味调控研究的突破点。

3 泡菜细菌与风味物质相关性研究

泡菜是一种多菌发酵体系，风味物质形成与微生物菌群密切相关，其中乳酸菌对风味起着重要作用，相关乳酸菌有Lactobacillus、Leuconostoc、Lactococcus和Weissella。目前，微生物与风味形成相关性研究主要聚焦在食品组学和发酵剂的应用。

食品组学(宏基因组学、代谢组学等)结合统计学分析(皮尔森相关系数等)可以预测复杂菌群中的优势微生物与风味成分之间的关联。XIAO等[34]研究发现细菌对四川泡菜风味的贡献比真菌大，Lactobacillus和Leuconostoc是泡菜中有机酸形成相关的最重要微生物，Leuconostoc和Lactobacillus分别与亮氨酸和脯氨酸密切相关，Lactobacillus、Leuconostoc与松油醇、(S)-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇密切相关。HE等[35]研究不同温度发酵酸菜，发现乳酸杆菌与13种挥发性成分呈显著正相关，Leuconostoc与1-己醇、顺-庚-4-烯醇、1-辛醇、芳樟醇、苯乙醇、苯丙醇、2,5-二甲基苯甲醛等呈显著正相关。LIANG等[36]研究不同盐度酸菜发现Lactobacillus可以显著提升酸菜挥发性成分，与醇类、酚类、含硫化合物和异硫氰酸酯呈显著正相关。XIAO等[37]研究3种传统泡菜发现Lactobacilli与超过20种风味化合物紧密相关，碳代谢、氨基酸和核苷酸是主要的代谢特征。

乳酸菌通常用作功能性发酵剂，用于稳定发酵食品品质，改善发酵食品的风味。接菌发酵产品具有发酵食品的典型特征，与自然发酵食品相比，具有更好的风味和更高的质量。XIONG等[38]分别采用L.mesenteroides、L.lactis、L.plantarum和L.casei发酵酸菜，发现L.mesenteroides和L.lactis生长较快，产乳酸早，但抗酸性较差，而L.plantarum和L.casei可以产生大量乳酸，具有更好的耐酸性。李啸等[39]研究发现自然发酵和单菌发酵泡菜中L.mesenteroides出现在发酵前期，产生大量乳酸和乙酸，Lactobacillus在中后期大量生长并代谢产生乳酸，乳酸产量远高于L.mesenteroides。JUNG等[40]采用L.mesenteroides发酵韩国泡菜可以更早消耗底物，产生更多乳酸、乙酸和甘露醇。L.plantarum和玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae)产少量乙酸，而L.casei几乎不产乙酸。

同时，不规范的生产操作或自然环境的影响下，泡菜中会长时间存在大量腐败菌，从而对泡菜风味品质存在一定影响。BREIDT等[41]研究腐败橄榄发现丙酸杆菌属(Propionibacterium)可将乳酸转化为丙酸和丁酸，引起发酵橄榄更严重的腐败。ZHANG等[42]发现地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)在腐败四川工业泡菜中产生异味。

大量研究从统计学角度确定微生物菌群结构与代谢物的关联性，但在多种微生物共同作用下很难确定各乳酸菌在泡菜中的作用及各菌种代谢的差异性，更无法量化乳酸菌的代谢能力，微生物之间的代谢机制还需要深入研究，才更有利于筛选功能微生物或采用基因工程对特定微生物进行改造，达到风味强化或发酵调控的目的。

4 结论与展望

泡菜作为发酵食品的典型代表，具有丰富的乳酸菌资源。四川泡菜、酸菜、韩国泡菜、涪陵榨菜等是我国消费者青睐的泡菜制品，因工艺、环境因子等差异，各泡菜产品细菌群落结构和风味特征具有共性和个性，风味形成与原料和细菌群落结构相关。本文综述了泡菜发酵过程中的风味化合物、细菌群落以及风味化合物与细菌之间的相关性的新兴技术，还综述了我国泡菜微生物发展和风味形成的关键代谢途径。

为阐明菌群和风味直接关联性，从而促进发酵过程并增强泡菜的风味，可针对以下方面进行研究：(1)确定不同泡菜特征性香气成分及其重要性和贡献度；(2)采用宏基因组学、宏转录组学、蛋白组学、代谢组学等手段研究单菌和多菌接种泡菜，解析微生物之间的群体效应、代谢和功能机制；(3)深入解析不同工艺泡菜环境因子、微生态和代谢产物相互关系，了解不同微生物在发酵过程中的代谢途径、揭示它们特定的功能和对风味的贡献，逐渐解析泡菜复杂风味和品质的成因；(4)基于特征风味对功能微生物风味特定基因进行改造，改变酶活力、调整前体物质浓度等达到定向调控香气相对浓度，为泡菜品质提升做好铺垫。