费氏弧菌检测土壤联合毒性模型分析

江伟，肖昕，王昆，吴晋芝，张良，陆方筱

(1.华侨大学 福建省生物化工技术重点实验室，福建 厦门 361021；2.华侨大学 化工学院，福建 厦门 361021)

被污染土壤中的重金属离子往往表现出化学污染物的联合毒性，即几种污染物会同时存在于现实环境中，暴露在其中的生物机体会受其影响而产生完全不同于单一化学污染物的生物学效应.这类两种或两种以上的化学污染物共同作用而产生的综合毒性作用，称为化学污染物的联合毒性作用[1-2].

发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌，荧光波长在420～660 nm之间[3].常见的菌属有异短杆菌属、发光杆菌属、希瓦氏菌属和弧菌属等[4].朱丽娜[5]等指出发光细菌毒性试验具有检测方法简单、对有毒物质反应灵敏、检测周期短、具有同高等动物相类似的理化特性(如呼吸作用，ATP水平变化，酶活性变化等)，能在短时间内得到准确的毒性数据等优点.发光细菌中的费氏弧菌(Vibriofischeri)属弧菌属，曾用来检测污水中的毒性物质[6]并作为一种单一重金属离子毒性的表征试剂[7].同时，费氏弧菌拥有培养成本低、繁殖周期短，耐受性强等优点，是探究联合毒性检测的理想材料.本文通过费氏弧菌相对发光强度与重金属离子的综合含量的关系，建立一个对土壤重金属综合含量进行定量分析的数学模型.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器有AOL-1型全光谱超微弱光检测器、摇床等.主要试剂有氯化钠、硫酸锌、硫酸铜、硫酸亚铁、氯化铅、乙酸铬、乙酸镍.五处采样地点的土壤样品.费氏弧菌冻干粉购自浙江托科司生物科技有限责任公司.

1.2 菌种的复苏及菌液的制备

取一份费氏弧菌冻干粉和一只复苏液，置于室温下平衡15 min.将2 mL复苏液注入冻干粉试剂瓶中，静置10 min.复苏完成后将费氏弧菌以1∶4的比例用2%的氯化钠溶液进行稀释，得菌稀释液.

1.3 单因素实验

分别配制浓度为0.3 mg·L-1的硫酸锌、硫酸铜、硫酸亚铁、氯化铅、乙酸铬、乙酸镍溶液作为单因素实验的待测液.将菌稀释液以1∶90的比例与待测液混合，反应时间为15 min.采用AOL-1型全光谱超微弱光检测器对混合后的样品进行检测，记录费氏弧菌在不同种类重金属离子中的发光强度.

在单因素实验中设置空白组，将费氏弧菌稀释液与2%氯化钠溶液以1∶90的比例混合15 min后检测其发光强度，并计算相对发光强度(相对发光强度=样品发光强度/空白发光强度).

1.4 响应面实验

计算单因素实验中每种重金属离子的相对发光强度.为确保模型的上限毒性足够大，选择毒性较大的3种重金属离子作为响应面实验的3个因素.参考赵莉等[8]的研究，设置水平分别为0.10，0.20，0.30 mg·L-1Pb2+；0.10，0.45，0.80 mg·L-1Ni2+；0.10，0.35，0.60 mg·L-1Cu2+，使用Design-Expert 8.0软件进行响应面结果分析.

1.5 样品土壤的采集和预处理

本研究选取五处土壤样品采集点，布置如表1所示.每一个采样点采集4份土样，分别采集距地表20 cm处深层土和地表浅层土，取样点分布在排污口和车间两处，采用随机取样的方法进行取样.

表2 响应面试验因素及水平

采集到土样后，剔除土壤中砂砾、石块、木棒、杂草、植物残根、昆虫尸体、石块，以及新生体锰结核和石灰结核等杂物，然后将土壤平铺在垫衬有干净白纸的晾晒板或木板上自然风干(严禁暴晒).当样品达到半干状态时，将大块土打碎，以免结成硬块，并在风干过程中，随时拣掉石砾、动植物残体.风干室保持干燥通风，风干温度为30～35 ℃，风干时间为3～7 d.将风干土用研磨棒磨碎，首先需将其过孔径为2 mm尼龙筛，再进一步用研钵反复研磨，过筛3～4遍，直至仅有少量沙粒方可停止，最后再过100目细筛.

1.6 土壤样品的制备

称取过筛后的土样，以土壤∶水=1∶5的比例配成土壤悬浊液，摇床震荡8 h，静置16 h后取得上清液；然后，用20 μm超滤膜进行过滤，将滤液以转速5 000～9 000 r·min-1，时间为3 min进行离心，得到无色透明的溶液即为待测土壤样品.

1.7 土壤样品的检测

将菌稀释液以1∶90的比例与待测样品混合，同时设立空白组.此空白组与单因素实验中的空白组相同.

2 实验结果与分析

2.1 单因素实验结果

在单因素实验中，计算可得硫酸铜、硫酸亚铁、氯化铅、乙酸铬和乙酸镍的相对发光强度(Ire)分别为17.12%，22.51%，12.52%，19.29%和12.10%.相对发光强度最低的前3种金属离子分别为Ni2+，Pb2+，Cu2+，故将它们作为响应面分析的3因素.

2.2 响应面实验分析

响应面试验因素及水平设计，如表2所示.使用Design-Expert 8.0软件进行响应面结果分析，如表3所示.表3中：I为发光强度.Box-Behnken试验设计结果方差分析，如表4所示.表4中：“*”表示P<0.05，具有统计学意义；“**”表示P<0.01，极具统计学意义；“-”表示P>0.05，不具有统计学意义.由表4可知：模型的F=10.98，说明该模型显著；失拟项P=0.238 9>0.05，即不显著，表明该模型在零水平处拟合较好，模型选择正确.

表3 响应面实验设计及结果

表4 Box-Behnken试验设计结果方差分析

各金属离子浓度交互作用对发光强度(I)影响的曲面图和等高线图，如图1所示.

(a)A(Pb2+)-B(Cu2+)

运用构建好的二阶经验模型来进行分析.对试验模型进行二阶回归拟合，得到回归方程为

上式中：A，B，C分别代表Pb2+，Cu2+，Ni2+，其中C的系数最大，表明Ni2+的浓度对费氏弧菌的发光强度的影响最显著.这可能是由于Ni2+的浓度梯度范围过大所导致，但本研究并未进行深入探讨.因素对费氏弧菌发光强度影响的主次顺序依次为Ni2+，Pb2+，Cu2+.当Ni2+浓度不变时，可以看出费氏弧菌的发光强度随着Cu2+浓度的上升先减小后变大，BC交互项(P>0.05)对发光强度的影响并不显著.

在最优条件下，各因素及响应值的取值如图2所示.从图2可知：当理论上的浓度值Pb2+=0.3 mg·L-1，Cu2+=0.1 mg·L-1，Ni2+=0.737 602 mg·L-1时，发光强度可以达到最大值960.015.

图2 各因素及响应值在最优条件下的取值

2.3 联合毒性模型的构建

利用响应面分析，拟合出不同离子配比下相对发光强度由强到弱的线性关系模型；然后，将此线性模型中离子综合浓度等比例放大和缩小，结果如表5，图3所示.图3中：Ire为相对发光强度；n为浓缩倍数.从表5，图3可知：不同倍数下，斜率相同，线性关系仍然成立，即在浓度条件改变下，配比不变，相对发光强度差值不变.但是在同一配比下，离子综合浓度不同，相对发光强度不同.

表5 不同稀释倍数下三元混合体系线性回归方程

(a)响应面模拟 (b)各离子浓度均缩小2倍

在此基础上，将离子配比固定，改变离子综合浓度，得到相对发光强度数值后，再次构建联合毒性模型，如图4所示.图4中：Ire为相对发光强度；ξ为毒性系数.首先定义毒性系数，将Pb2+∶Cu2+∶Ni2+的浓度比例为0.20∶0.35∶0.45时，定义毒性系数为1.即放大10倍，毒性系数就是10，放大0.3倍，毒性系数就是0.3，放大0.5倍，毒性系数就是0.5，以此类推.其次，进行毒性区间的划分，即Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级的毒性区间分别表示土壤的综合毒性相当于重金属离子含量分别为0.01，10，20 mg·L-1.

图4 联合毒性模型

2.5 模型在土壤检测中的应用

在对土壤检测的应用中，本实验分别采集了上述5个企业的深层和表层的土壤进行检测，结果如表6所示.表6中：Ire为相对发光强度；取样地靠近排污口为“样一”，靠近车间为“样二”.

表6 五个取样地点深层与表层土上清液对应相对发光强度

同一工厂不同采样点相对发光强度标准差(SD)对比，如图5所示.深层层土与表层层土的相对发光强度(Ire)对比，结果如图6所示.

(a)深层样一，深层样二 (b)表层样一，表层样二

图6 深层层与表层土相对发光强度对比

从图5可知：同一工厂“深层样一，深层样二”和“表层样一，表层样二”的相对发光强度有着相同的变化趋势，其中二化化工厂排污口和车间的土壤污染程度存较其他工厂存在较为明显的差异.从图6可知：深层土的生物毒性比表层土的要弱，即深层土壤的污染程度略低于表层土壤的污染程度.此外，所有土样毒性区间都在Ⅱ区，土壤的生物毒性相当于重金属离子含量101mg·L-1等级，生物毒性较小.

3 讨论

本研究采用响应面分析法得出费氏弧菌相对发光强度与重金属离子的综合含量的关系，将不同重金属的含量范围定义为不同的毒性区间，从而建立了一个可以对土壤重金属综合含量进行定量的数学模型.单因素实验中所得出的离子毒性从大到小排序为Ni2+>Pb2+>Cu2+>Cr6+>Fe2+，这与赵莉等[8]、杨虹[7]研究中Pb2+，Cu2+，Cr6+的毒性大小排序相符合.同时，本实验增加检测了镍、铬的毒性，而镍是合金、陶瓷染料等生活中常见的物品配方.此外，近年来推广的混合动力汽车多数使用的是镍氢动力电池[9]，报废的镍氢电池造成的城市污染也是不容小觑的.铬则一直作为合金生产等工业生产的重要元素，因此，铬渣带来的污染也同样值得关注.

不同放大倍数下费氏弧菌毒性的变化趋势，如图7所示.图7中：Ire为相对发光强度；ξ为毒性系数.从图7可知：费氏弧菌的相对发光强度在不同浓度重金属离子的作用下，存在“低浓度促进，高浓度抑制”的现象，即毒物兴奋效应(hormesis).此效应广泛存在于各类发光细菌检测中.它是指某种毒物在高浓度时对生物体产生负面作用，但在低浓度时对生物体却产生正面作用[10].Shen等[11]研究了Cu2+，Zn2+，Cd2+，Cr6+作为单一毒物对青海弧菌的影响，也发现了上述效应，并且还发现这种效应不随接触时间的改变而改变.此现象出现的可能原因是，发光细菌的发光反应是一种氧化反应，它会产生一种氧化产物黄素单核苷酸(FMN)[12].研究表明，FMN能够结合烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)提供的H+而被还原重新生成FMNH2[13]，从而使得发光能够连续进行.

(a)最弱毒性 (b)最强毒性

通过研究盐酸四环素对费氏弧菌发光的影响，汤淼等[14]发现低浓度的盐酸四环素会促进发光的原因在于，盐酸四环素相较于NADH更能提供所需的质子.一般情况下，重金属离子在水溶液中会存在一种水解反应，且浓度越低越能促进水解反应的发生.水解反应会使得溶液中存在一定量的H+，这一定量的H+可能促使FMN重新还原为FMNH2.这种效应的存在会产生一个相对发光强度最大值，在本实验的模型中将它称之为“拐点”.方便起见，将Pb2+∶Cu2+∶Ni2+浓度比例为0.20∶0.35∶0.45时的模型作为初步模型.

由于拐点的存在，本实验的模型在应用时可以借助其他数据来细化区间.根据赵莉等[8]的研究，汞离子对于费氏弧菌的毒性较强，不存在拐点.因此，当待测样品的相对发光强度可同时对应Ⅰ级毒性区间和Ⅲ级毒性区间，将该样品的相对发光强度带入汞离子与费氏弧菌相对发光强度进行对比.若该发光强度与汞离子浓度的对应值在0.09 mg·L-1以上，则认为毒性在Ⅲ级毒性区间；否则，在Ⅰ级毒性区间.此处，将0.09 mg·L-1作为判断Ⅰ和Ⅲ区间的原因是，正如杨虹[7]所述，发光细菌的相对发光强度随汞离子浓度的增加而逐渐减弱，当汞离子浓度大于等于0.09时，相对发光强度趋近于0，此浓度范围以上已经超过了生物法检测的范围，生物已经失活.在本文的模型中，金属离子综合浓度在200 mg·L-1浓度范围时，发光细菌尚未失活，但发光强度在逐渐减弱.因此，将0.09 mg·L-1作为判断离子浓度在Ⅰ还是Ⅲ区间的标准.

此外，毒性区间Ⅱ区的这个“拐点”，在理论上是难以通过实验的方法找出的，这与菌种对生物毒性的敏感度有关；再者，对于并非单因素水平实验，联合毒性受限于实验菌种的生物敏感性和各因素水平变化幅度的精确性，在实验水平上只能无限逼近这个拐点而很难找到拐点的具体数值.当然，“拐点”可以通过进行大量的实验缩小，得到更为精确的区间范围.

在现行的国家标准GB/T 15441-1995《水质急性毒性的测定发光细菌法》中，所用发光细菌为明亮杆菌，所测发光值对应的Hg2+浓度为土壤污染标准.相比费氏弧菌而言，明亮杆菌较喜低温环境，发光最适温度在18 ℃[15]；而费氏弧菌的发光最适温度在25 ℃[16]，更加方便在室温条件下进行操作.此外，土壤的成分复杂，其中可能包括多种金属氧化物或金属化合物，它们之间往往存在着复杂的联合毒性作用[17].本研究模型采用的是Pb2+，Ni2+，Cu2+等3种重金属离子三因素三水平联合毒性，相比于单因素或两因素单水平的毒性探究而言更加复杂，也能够更好地模拟土壤重金属生物毒性的复杂性.

本研究通过费氏弧菌相对发光强度与重金属离子的综合含量的关系，将不同重金属的含量范围定义为不同的毒性区间，建立了一个可以对土壤重金属综合含量进行定量的数学模型.此模型可以表示土壤中重金属离子的综合含量，同时也能表征土壤中重金属离子的联合毒性，可为后续的研究发展提供了新思路.