柱花草青贮早期发酵特性及3种植物蛋白酶活性动态研究

王 坚，李雪枫 ，郇树乾

(1. 海南大学 动物科技学院，海南 海口 570228；2. 海南大学 林学院，海南 海口 570228)

柱花草(Stylosanthesguianensis)是热带、亚热带地区广泛种植的优良豆科牧草，具有蛋白质含量高、适口性好等特点，是热带、亚热带地区畜牧养殖的主要粗饲料[1]。热带地区雨季、旱季分明，柱花草的生物量也出现雨季生长旺盛、蓄积较多，而旱季生长缓慢、蓄积较少的季节性波动，导致动物对其利用存在雨季过剩、旱季短缺的不平衡现象。为确保能够全年利用柱花草，以缓解动物饲草料供求不平衡，满足动物生产实际需要，将旺盛生长期利用过剩的柱花草制备为青贮饲料是一条理想途径[2]。牧草在青贮早期有大量蛋白质降解，导致青贮饲料中的非蛋白氮增加，使动物对青贮饲料中氮的利用效率低，降低了青贮饲料的营养价值[3]。研究表明，植物酶对饲草料青贮早期含氮化合物的广泛变化起主要作用[3]。

植物被收割后，体内的生物合成反应受到了限制，但青贮早期在有氧气和有用底物的条件下，植物酶仍然承担着呼吸作用和蛋白水解作用。McKersie[4]已经证实，初花期紫花苜蓿中至少存在酸性蛋白酶、羧基肽酶和氨基肽酶等3种植物蛋白水解酶，这些酶在青贮中的活性变化引起牧草青贮过程中蛋白质发生不同程度的水解，从而成为最终决定紫花苜蓿青贮饲料品质的重要因素之一[3]。目前，对于柱花草青贮的研究，主要集中在柱花草与农副产品混合青贮[2,5]、乳酸菌添加青贮[6-9]、青贮后有氧稳定性[10]及温度对其发酵品质的影响等[11]方面，对柱花草在青贮早期的发酵特性及其青贮时植物蛋白酶活性变化情况的研究报道较少，使人们对柱花草青贮发酵进程与发酵品质相关的各指标的变化动态尚不了解，对柱花草青贮饲料品质的调控也缺乏具体理论支撑。因此，本试验就柱花草不添加任何添加剂、也不与任何其它材料混合的情况下单独青贮，对其青贮早期的发酵特性和羧基肽酶、氨基肽酶与酸性蛋白酶活性的变化情况进行检测分析，为热带地区豆科牧草青贮利用提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

热研2号柱花草(Stylosanthesguianensis(Aublet) Swartz cv. Reyan No. 2)种子于2018年3月1日播种于海南大学农科基地，2018年8月2日刈割，此时为孕蕾期。柱花草的主要化学成分：干物质238.17±9.95 g/kg鲜重，干物质中粗蛋白、水溶性碳水化合物、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维分别为109.38±3.02、36.49±1.58、529.16±10.16和492.73±8.78 g/kg。

1.2 试验设计

采用单因素随机设计，将材料装至聚乙烯袋，分别在青贮0.5、1、2、3、5、7和14 d后打开取样，分析发酵品质和酶活性，每个时间点3个重复。

1.3 试验方法

1.3.1 青贮饲料制作 2018年8月2日用镰刀刈割柱花草取样，分装后将柱花草鲜样置于液氮中运至实验室，取少量柱花草鲜样用于测定鲜草酶活，其余用铡刀切短至2 cm左右，快速装入18×22 cm的聚乙烯青贮袋中，每袋150 g，抽真空后室温保存。

1.3.2 样品处理 按照试验设计在不同青贮时间点分别打开青贮袋，取出青贮料混匀，从中称取10 g，转入匀浆器，加入50 mL 0.1 mol/L的磷酸缓冲液(缓冲液pH 6.0，内含5 mmol/L硫代硫酸钠)匀浆。匀浆液经2层纱布过滤，滤液于4 ℃下10 000×g离心10 min，弃沉淀，上清液为酶粗提液，置于液氮中保存用于测定羧基肽酶、氨基肽酶和酸性蛋白降解酶活性。

另外称取35 g青贮料放入250 mL三角瓶，加入70 g去离子水置于冰箱4 ℃浸提24 h，收集滤液用来测定pH、乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)、丁酸(butyric acid，BA)、氨态氮(ammonia nitrogen，AN)。余下青贮饲料65 ℃烘干，用于测定总氮(total nitrogen，TN)。

1.3.3 测定指标和方法 用pH计测定(pHS-3C，上海佑科仪器仪表有限公司)。高效液相色谱色谱仪(日立LC-2000)测定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸，测定条件参数见文献[2]。氨态氮采用苯酚-次氯酸钠法测定[12]，总氮采用凯氏定氮法测定[13]。

羧基肽酶活性测定[4]：酶粗提液0.1 mL和2 mL底物溶液(2 mmol/L羧基苯氧基-L-苯基-丙氨酸溶于50 mmol/L乙酸钠缓冲液中，pH 5.2，含0.5 mmol/L EDTA)在40 ℃下培养2 h，将混合物在沸水中煮沸5 min。 冷却后，反应混合物中游离氨基酸按照Broderick和Kang[14]所述方法测定，酶活性表示为每克青贮饲料干物质每小时释放的游离氨基酸(μmol氨基酸释放/(h·g DM))。

氨基肽酶活性测定[4]：2 mmol L-亮氨酸-4-硝基苯胺作为底物溶于5 mmol磷酸-柠檬酸缓冲液中。酶粗提液0.5 mL和2 mL底物溶液混合，在40 ℃下培养2 h，沸水中煮沸5 min。 冷却后，在分光光度计上410 nm处测定吸收值。酶活性表示为每克青贮饲料干物质每小时在410 nm处吸光值(units/h·g DM))。

酸性蛋白酶活性测定[15]：反应混合物为0.3 mL 10 mg/mL的偶氮酪蛋白溶液，0.5 mL 0.2 mol/L的磷酸缓冲液(pH 6.0)，0.2 mL的酶粗提液。将混合物在40 ℃下培养2 h，然后添加2 mL 12%的高氯酸终止反应，反应液4 ℃下10 000×g离心10 min，弃沉淀，上清液在分光光度计上350 nm处测定吸收值。酶活性表示为每克青贮饲料干物质每小时在340 nm处吸光值(units/(h·g DM))。

1.4 数据处理与统计

采用SAS 8.0软件对试验数据进行单因子方差分析，采用Duncan法在P=0.05水平进行多重比较。图中3种酶活性均以占鲜样酶活性百分含量表示。

2 结果与分析

2.1 柱花草青贮饲料早期发酵动态变化

柱花草青贮早期发酵动态变化见表1。在柱花草青贮早期(青贮的前14 d内)，随青贮时间增加，青贮饲料的pH虽然呈现缓慢下降的趋势，但不同青贮时间的pH差异并不显著(P>0.05)。青贮第2天乳酸含量显著增加(P<0.05)；第3～5天保持稳定，第7天再次显著增加(P<0.05)，第14天含量达最大值13.91 g/kg DM。青贮第0.5～1天，乙酸含量差异不显著(P>0.05)，第2天显著增加一直持续到青贮结束；整个青贮期间丙酸含量较低，但从青贮第2天开始显著增加(P<0.05)，第14天其值为1.77 g/kg DM；青贮第1天有少量丁酸产生，第2天后丁酸含量显著增加直到试验结束(P<0.05)；随着青贮时间的延长，LA/AA值逐渐降低，由第1天的1.11最后显著降低到0.59(P<0.05)；氨态氮/总氮值从青贮第2天起显著增加(P<0.05)，在青贮最后达181.16 g/kg TN。

表1 柱花草青贮早期发酵动态变化Table 1 Changes in fermentation qualities in Stylosanthes guianensis silage during the early stage of ensiling

2.2 柱花草青贮饲料中三种植物蛋白酶活性变化

柱花草青贮饲料中氨基肽酶、羧基肽酶和酸性蛋白酶活性检测结果见图1。

2.2.1 氨基肽酶的活性变化 柱花草青贮早期，随青贮进行，青贮饲料的pH呈下降趋势，第0.5天时为6.09，第14天时降至5.48。随pH降低，氨基肽酶活性(占鲜样酶活性百分比)呈逐渐降低的趋势(图1)。柱花草鲜草的氨基肽酶活性为45.70 units/(h·g DM)，青贮0.5 d时其活性降低11.79%，1 d时的活性显著降至鲜样时的70.81%(P<0.05)，青贮2 d时的氨基肽酶活性与青贮1 d时无显著差异(P>0.05)，但青贮3 d后氨基肽酶活性又显著下降(P<0.05)，至青贮7 d时氨基肽酶的活性降为2.42 units/(h·g DM)，仅为其鲜样活性的5.30%，第14天时氨基肽酶的活性为0(图1)。

图1 柱花草青贮早期3种植物蛋白酶活性变化同一种酶不同小写字母表示差异显著(P<0.05)Fig. 1 Changes in activity of three plant proteinase in Stylosanthes guianensis silage during theearly stage of ensilingDifferent lowercase letters for the same enzymeindicate significant difference(P<0.05)

2.2.2 羧基肽酶的活性变化 青贮早期，柱花草青贮饲料的羧基肽酶的活性(占鲜样酶活性百分比)随pH的降低和青贮时间的延长逐渐降低。柱花草鲜草的羧基肽酶活性为每克干物质每小时释放游离氨基酸122.60 μmoL。青贮前3 d，羧基肽酶活性随青贮进程每天显著降低(P<0.05)，至第3天时降至鲜草活性的56.32%；第3～5天时，羧基肽酶活性的减低趋势减缓(P>0.05)；虽然青贮至第7天时羧基肽酶活性比第3天时降低14.21%，为鲜草活性的48.30%(P<0.05)，但之后其活性基本保持不变，至第14天时其活性为每克干物质每小时释放游离氨基酸56.15 μmoL(是鲜草活性的45.8%)(图1)。

2.2.3 酸性蛋白酶的活性变化 青贮早期，柱花草青贮饲料的酸性蛋白酶的活性(占鲜样酶活性百分比)也随pH的降低和青贮时间的延长逐渐降低。柱花草鲜草的酸性蛋白酶活性为13.10 units/(h·g DM)。青贮0.5～1 d时，酸性蛋白酶活性变化显著(P>0.05)，第2天和第3天时酸性蛋白酶活性持续显著降低(P<0.05)，第3天时已降至鲜样时的55.21%；之后酸性蛋白酶活性的降低趋势减缓，至青贮第14天时其活性为5.6 units/ h·g DM，是鲜样时的42.75%(图1)。

3 讨 论

3.1 柱花草青贮早期发酵特性

整个青贮早期，柱花草青贮饲料的pH均比较高(5.48～6.09)，推测是青贮早期没有产生足够的乳酸来降低pH，而较低的乳酸含量(2.59～13.91 g/kg DM)也印证了这一推测。乳酸产量较低的原因在于柱花草材料中水溶性碳水化合物含量仅为36.49 g/kg DM，远低于乳酸菌产酸的需要量(≥100 g/kg DM)[16]，这可能影响到青贮饲料的长期保存。本试验中青贮早期的发酵产物以乙酸为主，这一结论与象草等其它热带牧草青贮的结果相似[17-18]，Pettersson 和Lindgren[19]的研究结果也表明青贮饲料含有高含量乙酸的原因与青贮材料的碳水化合物含量较低有非常紧密的关系。柱花草青贮第14天的丙酸和丁酸含量虽少，但与第7天相比较显著增加，表明梭菌和丙酸菌的活性在第14天时还未得到完全抑制，可能是青贮前7 d 的pH仍然较高所致。Yokota等[17]和Miyagi等[20]认为热带牧草青贮主要是乙酸型发酵，是由于其较低的碳水化合物含量和较高的缓冲能，尽管本试验没有测定柱花草青贮材料的缓冲能，但试验中乳酸/乙酸(LA/AA)的值低于1表明柱花草青贮发酵是以乙酸型发酵为主，可推测青贮原料的低碳水化合物含量对其乙酸型发酵起着重要作用。随着青贮进行，丁酸和氨态氮/总氮(AN/TN)的值逐渐增加，特别是试验结束时(第14天)氨态氮/总氮的值是好青贮饲料氨态氮/总氮值标准(≤80 g/kg TN)[21]的2.26倍，说明由于柱花草直接青贮时碳水化合物含量低，不能快速产生足够的乳酸来降低pH，使有害微生物活性未得到有效抑制，形成了丁酸，并将蛋白质降解为氨态氮[16]，导致青贮饲料品质变差。

3.2 青贮早期植物酶蛋白酶活性变化情况

植物蛋白酶在细胞内对细胞蛋白质循环和降解起着作用，在牧草饲料作物青贮时，由于收获期间机械破坏或由于厌氧条件下细胞破裂，蛋白水解酶被释放，将细胞质蛋白水解为短链肽和游离氨基酸[4]。本试验中，羧基肽酶和酸性蛋白酶在青贮14 d后仍然具有活性，说明它们是青贮早期水解柱花草青贮饲料蛋白质的主要酶类。氨基肽酶在青贮第7天酶活仅为鲜样的5.30%，14 d后酶活性为0，与Yuan等[22]在紫花苜蓿中得到的研究结果相似。 Guo等[23]的研究表明氨基肽酶在紫花苜蓿青贮第4天就失去了活性，而李旭娇[24]的研究结果表明氨基肽酶在紫花苜蓿青贮35 d后仍具有非常低的活性，两者研究结果与本试验氨基肽酶失活时间的不一致，可能与青贮pH、温度和处理时间有关[25-27]。随青贮时间的延长，羧基肽酶和酸性蛋白酶活性逐渐降低，但羧基肽酶活性降低的速度较酸性蛋白酶和氨基肽酶慢(青贮结束后分别为鲜样活性的45.8%、42.75%和0)，这与其他学者对紫花苜蓿青贮的研究结果相似[22-23，28]。pH是影响青贮饲料蛋白质水解的主要因素之一，适合紫花苜蓿蛋白酶水解的最佳pH是5.5～6.0[26-27]；Heron等[29]研究发现意大利黑麦草中的蛋白酶在较宽的pH范围内仍保持活性，该pH范围被认为是代表了几种具有不同最佳pH的蛋白酶的联合活性。本试验pH在6.09时，氨基肽酶、羧基肽酶和酸性蛋白酶均具有较高的活性(分别为鲜样活性88.21%、90.07%和90.99%)；pH在5.92时，氨基肽酶活性已下降到9.69 units/(h·g DM)，仅为鲜样活性的21.2% ，但羧基肽酶和酸性蛋白酶活性仍高于50%(分别为鲜样活性的56.32%和58.63%)；在pH为5.48时，氨基肽酶活性已经失活，而羧基肽酶和酸性蛋白酶还分别保持着鲜样活性的45.8%和42.75%，说明每种酶活性的最佳pH和失活范围不一样。本试验中3种植物蛋白酶活性均随青贮时间的延长而下降，但每种蛋白酶活性在不同pH稳定性不一样，它们都是独立下降，与McKersie和Buchanan-Smith[28]研究结果相一致。

4 结 论

柱花草青贮发酵早期pH高，乳酸含量低，氨态氮/总氮高，发酵品质差；3种蛋白酶活性均随青贮进行而下降，氨基肽酶活性失活时间较羧基肽酶和酸性蛋白酶早，在进行柱花草青贮时可考虑添加发酵促进剂或蛋白酶抑制剂，以降低酶活性，减少蛋白分解，提高青贮饲料品质。