二氧化硅纳米颗粒表面原位还原银纳米簇电化学发光传感界面的构建与分子识别

王博东，潘美辰，卓 颖

（发光分析与分子传感教育部重点实验室(西南大学),西南大学化学化工学院,重庆400715）

电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）是电化学反应引发的化学发光现象［1］.ECL技术无需外部光源，避免了散射光引起背景信号的干扰，提高了分析的灵敏度.其次，通过调控电压或电流的大小可以实现对反应进程的精确控制，使ECL展现出良好的可控性及重现性.此外，经历多个循环周期后，ECL发光信号仍能保持稳定，保证了分析方法的准确度.将ECL技术与生物传感技术相结合的ECL生物传感器具有灵敏度高、重现性好、线性范围宽和背景信号低等优点［2］，为环境、临床及食品等领域提供了快速、高效的检测手段.

L-半胱氨酸（L-Cystein，L-Cys）是人体内唯一的还原型氨基酸，在生化过程中能够阻止活性氧对重要细胞成分破坏从而使生命体内氧化还原过程处于平衡态［3］.人体内L-Cys含量过高会引起神经中毒、癌症等疾病，然而，含量过低与脑损伤、头发脱色、虚弱无力等不良症状的发生有紧密联系［4］，及时、准确地监测人体细胞中L-Cys的含量对预防及治疗上述疾病有重要意义.

随着纳米科技的不断进步，发展新型、高效、简便易得的电化学纳米发光体是ECL研究领域的重要方向.银纳米簇（Silver nanoclusters，Ag NCs）是由几到几十个贵金属原子堆积而成，化学性质较活泼，容易氧化而发生聚集，导致其光稳定性较差［5］.将Ag NCs与石墨烯（GR）［6］、二氧化钛（TiO2）［7］及二氧化硅（SiO2）［8］等纳米材料复合，可为优化其光学性能提供一种思路.二氧化硅纳米颗粒（SiO2NPs）具有均一的尺寸、较大的比表面积，且化学稳定性高，是负载小尺寸纳米材料的优良基质［9］.Le Guevel等［10］通过在金纳米簇（Au NCs）表面包覆具有保护作用的二氧化硅，有效提高了Au NCs的光稳定性及化学稳定性，但受表面硅层的影响，其发光强度有所下降，不利于痕量分析.本文借助原位化学还原的方式以牛血清蛋白（BSA）同时作为模板和还原剂使得Ag NCs稳定负载于SiO2NPs表面.一方面，空间限域的Ag NCs难于发生团聚，显著增强其光学稳定性.同时，Ag NCs处于SiO2NPs表面，SiO2NPs对ECL电子转移过程并无阻碍，ECL强度得到显著提高.因此，Ag NCs-SiO2NPs复合纳米材料在共反应试剂过硫酸根溶液中产生显著增强且稳定的阴极ECL信号.当溶液中含有L-Cys时，L-Cys的巯基与Ag NCs发生共价结合［11］，ECL信号发生猝灭.基于上述原理，构建了“开-关”型ECL生物传感器用于L-Cys的定量检测，为分子识别提供了新方法.

1 实验部分

1.1 试 剂

过硫酸钾（K2S2O8）、牛血清蛋白（BSA，纯度96%~99%）、正硅酸乙酯（TEOS）、氨水（NH3·H2O，质量分数25%~28%）、乙醇（C2H5OH）和壳聚糖（CS）均为分析纯，购自美国Sigma公司；L-半胱氨酸（L-Cys）和尿素（Urea）均为分析纯，购自上海Aladdin公司；氢氧化钠（NaOH）和葡萄糖（Glucose）均为分析纯，购自成都科隆化学试剂有限公司.实验用水均为二次去离子水.

1.2 生物传感器的制备

1.2.1 Ag NCs-SiO2NPs纳米复合材料的制备 首先，通过Stöber方法［12］合成SiO2NPs.在磁力搅拌下向20 mL无水乙醇中缓慢滴加3 mL NH3·H2O.1 min后，快速向其中加入600μL TEOS.在25℃下磁力搅拌12 h后，离心并用去离子水和无水乙醇洗涤3次.在37℃烘箱中干燥12 h，备用.

1.2.2 Ag NCs-SiO2NPs的制备 取24.0 mg SiO2NPs分散于2 mL去离子水中并超声混合均匀.在磁力搅拌下，加入1 mL 3%BSA溶液（pH=7.4），反应5 min后，离心并用去离子水洗涤3次.然后将上述产物分散于2 mL去离子水中，并向其中加入1 mL 10 mmol/L AgNO3溶液，磁力搅拌2 min后，加入0.2 mL 1 mol/L NaOH溶液，溶液由乳白色变为棕黄色.在37℃下搅拌12 h后，离心去除上层清液，用去离子水洗沉淀3次.最后超声分散于2 mL去离子水中，在4℃冰箱保存，备用.制备过程见Scheme 1.

Scheme 1 Preparation process of Ag NCs⁃SiO2 NPs

1.2.3 修饰电极的制备 用α-氧化铝粉末对玻碳电极（GCE，φ=4 mm）进行打磨抛光，并用无水乙醇和去离子水分别进行3次超声清洗.用移液枪吸取5μL 1%CS滴涂于GCE表面，于37℃下晾干备用.取5μL超声后分散均匀的Ag NCs-SiO2NPs滴加至上述修饰了CS的GCE表面，于37℃下晾干成膜.

1.3 表征与检测方法

实验所用三电极体系由工作电极玻碳电极、参比电极Ag/AgCl（饱和KCl溶液）电极以及辅助电极铂丝电极共同组成.CHI660C型电化学工作站（上海辰华仪器公司）用于ECL检测.MPI-A型毛细管电泳电化学发光检测仪（西安瑞迈分析仪器有限公司）用于循环伏安（CV）检测.S4800扫描电子显微镜（SEM）和JEM 1200EX投射电子显微镜（TEM，日本日立公司）用于观测材料的形貌和结构.采用UV-2450型紫外Vertex电化学工作站（荷兰Ivium公司）、Kymera 193i型光谱仪与牛顿EMCCD光谱检测器（英国Andor Co.公司）自主搭建的ECL光谱系统表征材料的ECL光学特性.FL-5700型荧光分光光度计（日本日立公司）用于表征材料的荧光特性.UV-3600型紫外-可见分光光度计（UV-Vis-NIR，日本日立公司）用于表征材料的紫外-可见吸收特性.

2 结果与讨论

2.1 Ag NCs-SiO2 NPs的形貌表征

采用SEM对所制备的SiO2NPs的表面形貌进行表征.如图1（A）所示，所制SiO2NPs为球形，粒径均一，直径大约为180 nm.通过TEM对所合成的Ag NCs-SiO2NPs的表面形貌及结构进行分析，发现SiO2NPs的边缘形成大量颗粒［图1（B）］.同时，通过高分辨透射电子显微镜（HRTEM）表征该材料，显示出分辨良好的晶格条纹［图1（C）］，0.15 nm的晶间距离对应于面心立方（fcc）银的（220）面［13］，推测Ag NCs已成功制备.为了进一步表征该复合材料的元素组成，通过扫描透射电子显微镜-高角环形暗场（STEM-HAADF）和扫描透射电子显微镜-能量色散X射线（STEM-EDX）观察Ag与Si两种元素在该复合材料中的组成及分布情况［图1（D）］，明显可见Ag元素存在于SiO2NPs的边缘.综上，可以证明SiO2NPs表面已原位生成了Ag NCs.

Fig.1 SEM images of SiO2 NPs(A),magnified TEM images of Ag NCs⁃SiO2 NPs(B),HRTEM image of Ag NCs⁃SiO2 NPs(C),STEM⁃HAADF image of SiO2 NPs⁃Ag NCs and STEM⁃EDX element mappings(inset)of Ag and Si,respectively(D)

2.2 Ag NCs-SiO2 NPs的光学性质

为了研究所制备Ag NCs-SiO2NPs的光学性质，测试了其紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱、荧光（FL）光谱及ECL光谱.首先，为了探究Ag NCs-SiO2NPs逐步合成的过程，采用UV-Vis吸收光谱仪对BSA，SiO2NPs及Ag NCs-SiO2NPs进行分析.由图2（A）可见，SiO2NPs的UV-Vis光谱中没有明显的特征吸收峰［图2（A）谱线a］，BSA的特征吸收峰出现在278 nm［图2（A）谱线b］.值得注意的是，Ag NCs-SiO2NPs的特征吸收峰位于266 nm左右［图2（A）谱线c］，推测该吸收峰来源于BSA的芳香族残基及二硫键［14］，12 nm蓝移可能源于Ag NCs的量子尺寸效应［15］.根据文献［16］报道，银纳米颗粒（Ag NPs）的表面等离子体共振（SPR）峰处于400 nm附近，Ag NCs-SiO2NPs的UV-Vis光谱并未显示该峰，这可能是由于SiO2NPs表面负载的Ag NCs尺寸较小.

2.3 Ag NCs-SiO2 NPs/S2O的ECL机理

2.4 实验条件的优化

探究了合成条件中AgNO3溶液浓度对体系ECL信号的影响.由图4（A）可见，当AgNO3浓度低于5 mmol/L时，ECL信号随AgNO3浓度的增加而升高.可以推测，随着溶液中AgNO3含量的增加，SiO2NPs表面原位生成的Ag NCs逐渐增多，引起ECL信号升高.当AgNO3浓度达到5 mmol/L时，所检测的ECL信号达到13600 a.u.，达到最高值.随着AgNO3浓度继续增加，ECL信号开始呈现下降的趋势.这主要由于AgNO3浓度过大使得生成的Ag NCs尺寸增大，导致ECL信号降低.因此，5 mmol/L即为合成Ag NCs-SiO2NPs所用AgNO3的最佳浓度.

在其余实验条件不变的情况下，研究了扫描速率对上述传感器的影响［图4（B）］.当扫描速率为0.3 V/s时，ECL信号达到相对较高的值，且稳定性较高.故选择0.3 V/s作为分析检测的最佳扫描速率.

Fig.4 Effects of AgNO3 solution concentration(A)and scan rate(B)on ECL signal

Fig.5 ECL signals of the biosensor with different concentrations of L⁃Cys in 10 mmol/L S2Osolution(pH=7.4)(A),calibration plot for L⁃Cys detection(B),the stability of the biosensor(C)and the selectivity of the biosensor(D)

2.5 传感器的检测性能

为了测试上述传感器的定量检测范围，将其置于含有不同浓度L-Cys的10 mmol/L S2O溶液中测试ECL响应.如图5（A）所示，当L-Cys浓度在50 nmol/L~50μmol/L范围内，ECL信号随着L-Cys浓度的增加而降低.ECL信号的变化值（ΔI为ECL信号与空白信号的差值）与L-Cys浓度的对数值呈线性关系，其线性回归方程为ΔI=5140.3+2679.3lgcL-Cys，R2=0.9969［图5（B）］.根据3σ规则［19］，计算出其最低检测限（LOD）为13.7 nmol/L.

为了研究所构建生物传感器的稳定性，将其置于10 mmol/L S2O82−溶液中，连续电位扫描8次并记录其ECL信号［图5（C）］.所收集的ECL信号相对标准偏差（RSD）为2.3%，表明该传感器具有良好的稳定性.

生物传感器选择性是评估其实际应用价值的重要指标之一，为了探究所制备传感器的选择性，有必要选择不同的干扰物进行对比.分别测试了含有500μmol/L尿素（Urea）、葡萄糖（Glucose）、抗坏血酸（AA）的溶液及空白溶液［图5（D）］.与空白溶液对比，向体系中加入浓度为50μmol/LL-Cys后，由于L-Cys与Ag NCs-SiO2NPs的结合破坏了Ag NCs的表面结构，使得所检测的ECL明显信号下降.而将上述干扰物质以高于L-Cys浓度的10倍加入时，干扰物质对检测的ECL信号几乎没有影响，说明该传感器对L-Cys具有良好的选择性.

最后，将该ECL测试方法与其它检测L-Cys的方法进行比较.由表1［4，20~25］可见，本文所构建的传感器具有较宽的线性范围和较低的检测限（LOD），说明其适用于L-Cys的高灵敏检测.

Table 1 Comparison of different methods for the detection of L-Cys

3 结 论

采用原位化学还原法制备了Ag NCs-SiO2NPs复合纳米材料作为新型电化学发光体，在溶液中发射稳定的阴极ECL信号.SiO2NPs具有大的比表面积和高的化学稳定性，为原位生成Ag NCs提供了合适固载基质使其光稳定性得以提高.基于L-Cys对ECL信号的猝灭作用，构建“开-关”型ECL生物传感器用于L-Cys的高灵敏检测.结果表明，该生物传感器检测L-Cys的浓度线性范围为50 nmol/L~50 μmol/L，具有较低的检测限，能够特异性识别L-Cys.本文所研究的传感器具有高的灵敏度和好的重现性，组装过程简单，有望在生物分析方面得到应用.