ALC1、miR-1299、COL5 A2与食管癌恶性生物学行为的关系及预测胸腹腔镜外科手术后复发的效能

杨三虎 何伟

食管癌(esophageal cancer，EC)为临床常见消化道肿瘤，多发于40岁以上人群，典型的症状为进行性咽下困难，严重影响患者生命健康及生活质量[1,2]。手术为治疗EC最重要的方法，尤其是以胸腔镜为代表的微创手术，较传统手术具有更高有效性及安全性，临床应用广泛[3]。国内外均有报道指出，EC恶性生物学行为如肿瘤分化程度、淋巴转移、肿瘤浸润深度等，是肿瘤术后复发的危险因素[4,5]。研究指出，EC患者ALC1基因表达升高，可增强癌细胞增殖、侵袭及转移能力，导致EC总生存率下降[6]。微小RNA-1299(miR-1299)被证实在EC组织中的表达水平降低，可能与癌细胞的迁移和侵袭能力相关[7]。此外，V型胶原蛋白α2链(COL5-A2)被认为是食管鳞癌发生、发展的关键基因，与患者预后密切相关[8]。基于此，本研究尝试探究ALC1、miRNA-1299、COL5-A2与EC恶性生物学行为的关系及预测胸腹腔镜外科手术后复发的效能，旨在为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年10月至2019年6月西安军医大学唐都医院胸腹腔镜外科手术治疗后1年内复发的EC患者45例，作为研究组，其中男25例，女20例；年龄49～78岁，平均年龄(64.25±6.86)岁。另选取胸腹腔镜外科手术治疗后1年内未复发的EC患者45例，作为对照组，其中男28例，女17例；年龄47～79岁，平均年龄(63.58±7.7)岁。2组一般资料具有均衡性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①EC的诊断及复发诊断均参照相关标准[9]，并经病理诊断确诊；②符合EC手术指征[10]；③无神经系统疾病、心理障碍；④临床资料完整；⑤患者知晓本研究，已签署同意书。

1.2.2 排除标准：①血液系统疾病患者；②合并其他恶性肿瘤者；③严重心脑血管疾病患者；④免疫性疾病、感染性疾病患者；⑤肝肾等脏器功能严重障碍者。

1.3 方法

1.3.1 EC组织指标检测方法：2组术后均留取EC组织，并于入组当天取活检组织，采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组织中ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA表达水平，具体操作如下：称取待检组织100 mg，置于EP试管中，加入1 ml裂解液后充分研磨，随后于低温下提取总RNA，核酸测定仪测定RNA含量，将RNA反转录为cDNA，并进行扩增，条件为95℃ 5 min；95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共40个循环，ALC1引物上游序列为：5’-GGTGGAGTTGGCATGA

ACTT-3’，下游序列为：5’-CACTCAACTGGAGGTCAG

CA-3’；miR-1299引物上游序列为：5’-TAAAGGTATG

GAGCGATGTGA-3’，下游序列为：5’-GGGTAGCGAA

AGGTGTAGAAG-3’；COL5 A2引物上游序列为：5’-AGGAACAGAAGTGCGAGGAGG-3’，下游序列为：5’-GGATGGAGTTGTCGGTGTAGATG-3’；上下游引物均购自广州锐博生物科技有限公司，采用2-ΔΔCt法计算ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA表达水平。

1.3.2 血清恶性生物学行为指标检测方法：包括血清半乳凝素-9(galectin-9，Gal-9)、血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)、半乳糖凝集素-3(galectin-3)，采集患者术前空腹静脉血3 ml，以3 500 r/min转速、8 cm半径离心处理5 min，取血清置于-70℃冷藏室保存，采用酶联免疫吸附试验检测上述指标水平，试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司，检测操作由专业人员严格按照试剂盒说明书完成。

1.4 观察指标 (1)2组一般资料及血清Gal-9、VEGF、Galectin-3水平，一般资料包括年龄、性别、体质量指数(Body mass index，BMI)、吸烟、病理分型史、肿瘤位置、合并症。(2)2组术后、入组时EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA表达情况。(3)探究术后EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA与血清恶性生物学指标的相关性。(4)术后EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2高表达与低表达者病理特征，包括年龄、性别、BMI、吸烟、病理分型史、肿瘤位置、合并症、肿瘤分期、分化程度、淋巴转移、肿瘤浸润深度，肿瘤分期、分化程度、淋巴转移、肿瘤浸润深度均于术前参照相关指南[11]进行评估。(5)探究术后EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2表达水平与恶性生物学行为的关系，及预测EC术后复发的效能。

2 结果

2.1 2组一般资料、血清恶性生物学行为指标比较 2组患者年龄、性别比、BMI、吸烟、病理分型史、肿瘤位置、合并症比较差异无统计学意义(P>0.05)；研究组患者血清Gal-9、VEGF、Galectin-3水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组一般资料、血清恶性生物学行为指标比较 n=45,例(%)

2.2 2组EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA比较 研究组术后、入组时EC组织ALC1、COL5-A2 mRNA均较对照组高，miR-1299 mRNA较对照组低(P<0.05)。免疫组织化学法检测显示，研究组术后、入组时EC组织ALC1、COL5-A2呈强阳性表达，miR-1299呈弱阳性表达；对照组术后、入组时EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2呈弱阳性表达，miR-1299呈强阳性表达。见表2。

表2 2组EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA相对表达量比较

2.3 ALC1、miR-1299、COL5-A2高表达与低表达者病理特征比较 以术后EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2平均值作为分界点，分为高表达、低表达患者。高表达与低表达患者的年龄、性别、BMI、吸烟、病理分型史、肿瘤位置、合并症差异无统计学意义(P>0.05)；高表达与低表达患者的肿瘤分期、分化程度、淋巴转移、肿瘤浸润深度比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 ALC1、miR-1299、COL5-A2高表达与低表达者病理特征比较 例(%)

2.4 ALC1、miR-1299、COL5-A2表达与血清恶性生物

学行为指标的相关性 Spearman相关系数模型分析相关性，发现术后EC组织ALC1、COL5-A2表达与血清Gal-9、VEGF、Galectin-3间正相关，miR-1299与血清Gal-9、VEGF、Galectin-3间呈负相关(P<0.05)。见图1～3。

图1 ALC1与血清恶性生物学行为指标的相关性

2.5 ALC1、miR-1299、COL5-A2与恶性生物学行为的关系 Spearman相关系数模型分析相关性，发现术后EC组织ALC1、COL5-A2表达水平与肿瘤分期、分化程度、淋巴转移、肿瘤浸润深度间存在正相关关系，miR-1299表达水平与肿瘤分期、分化程度、淋巴转移、肿瘤浸润深度间存在负相关关系(P<0.05)。见表4。

图2 COL5-A2与血清恶性生物学行为指标的相关性

图3 miR-1299与血清恶性生物学行为指标的相关性

表4 ALC1、miR-1299、COL5-A2表达水平与恶性生物学行为的相关性分析

2.6 ALC1、miR-1299、COL5-A2预测复发的效能 绘制术后EC组织ALC1、miR-1299、COL5-A2联合预测EC术后复发的ROC曲线，显示各指标联合预测的AUC最大，为0.872，最佳预测敏感度、特异度分别为86.67%、80.00%(P<0.05)。见表5，图4。

表5 ALC1、miR-1299、COL5-A2预测复发的效能

图4 ALC1、miR-1299、COL5-A2预测复发的ROC

3 讨论

调查显示，2018年全球36种癌症中，EC的发病率和死亡率分别居第7位和第6位[12]。尽管近年来EC的诊断技术和多学科治疗取得明显进展，但EC患者的5年生存率仍然低于20%[13,14]。肿瘤的复发转移，是导致预后不佳的主要因素，积极探索相关特异性生物标志物，对控制肿瘤进展、延长患者生存期具有重要意义[15,16]。

近年来，基因诊断与基因治疗在恶性肿瘤中的作用越来越受临床重视。ALC1为肝癌的最新候选癌基因，是从人体肝癌细胞的染色体1q21区分离并克隆的一个新基因，具有调控基因转录的功能，也是SNF-2类家族中具有致癌作用的基因[17,18]。但其在EC发生发展及复发中的作用鲜有研究报道。本研究发现，EC组织中ALC1基因表达水平明显升高，胸腹腔镜外科手术后其表达水平呈降低趋势，但EC术后复发患者的EC组织中ALC1基因表达水平高于未复发患者，提示ALC1基因表达可能与EC的发生发展及术后复发有关，可能与其调控下游基因及促进细胞增殖相关。ALC1基因具有上调Cdk2及细胞周期蛋白CyclinE、下调蛋白p53及其下游效应基因p21表达的作用，能加速细胞G1期到S期的进程，且能促进DNA合成，从而促进肿瘤细胞增殖，导致肿瘤进展、复发[19]。

miR是一类高度保守的非编码RNA，越来越多的证据指出miR在癌症的基因表达调控和信号转导通路中发挥关键作用[20,21]。有报道指出miR-1299可通过负向调控信号转导及转录激活因子3信号通路，抑制癌细胞的迁移、侵袭[22]。本研究还发现，EC组织中miR-1299表达水平明显降低，手术治疗后其表达水平有升高，但术后复发患者的EC组织中miR-1299表达水平仍明显偏低，可能与EC发生发展、术后复发有关。本研究还发现，COL5-A2基因在EC组织中的表达明显升高，且术后复发患者高于未复发患者。COL5-A2是胶原家族的重要成员，被认为与癌症发生有关，已有研究证实其在舌鳞状细胞癌、膀胱癌组织中的表达均升高，可促进癌细胞增殖、转移[23]。但其在EC中的具体作用机制尚未明确，仍有待进一步探究。

本研究分析其与EC患者血清Gal-9、VEGF、Galectin-3水平的相关性，结果发现血清Gal-9、VEGF、Galectin-3与术后EC组织ALC1、COL5-A2表达呈正相关，与miR-1299表达呈负相关。Gal-9可诱导巨噬细胞、T细胞、胸腺细胞等多种类型细胞的凋亡，与肿瘤的凋亡、转移等机制密切相关[24,25]。VEGF为肿瘤血管生成的主要推动因子，可促进肿瘤内新血管形成，为肿瘤的增殖、转移提供动力[26]。Galectin-3具有调节细胞生长、黏附、分化及凋亡的作用，可促进食管癌新血管生成及肿瘤的浸润、转移[27]。由此可见，ALC1、miR-1299、COL5-A2与EC恶性生物学行为有关。本研究还发现，肿瘤分期、分化程度、淋巴转移、肿瘤浸润深度与术后EC组织ALC1、COL5-A2呈正相关，与miR-1299呈负相关，进一步证实了ALC1、miR-1299、COL5-A2与EC恶性生物学行为均存在密切相关性。基于上述研究，我们首次采用ROC曲线探究ALC1、miR-1299、COL5-A2预测EC术后复发的效能，结果发现各指标预测EC术后复发的AUC均>0.7，具有良好预测价值，尤其是各指标联合预测的AUC高达0.872，可为临床预测患者术后复发风险提供更准确信息。

综上所述，EC组织中ALC1、miR-1299、COL5-A2基因表达异常，与EC恶性生物学行为密切相关，且各指标联合在预测患者术后复发方面具有良好效能，具有较高临床应用价值。