响应面法优化发酵香肠的低钠复合盐配方

王宁宁，冯美琴，孙 健,

（1.南京农业大学食品科学技术学院，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏南京 210095；2.金陵科技学院动物科学与食品工程学院，江苏南京 210038）

发酵香肠是具有特殊的发酵风味和微生物稳定性的肉制品，是通过充分混合搅碎的瘦肉、动物脂肪、盐、糖、发酵剂和各种香辛料，再进行灌肠、发酵、干燥和成熟而制成[1]。食盐在肉制品的制作中不可或缺，它可以增强咸味、增加风味、防腐抑菌和提高产品持水性[2-3]。约2%～3%食盐在制作初期加入到发酵香肠中，成品中的食盐含量甚至达到6%[4]。目前人们膳食中有钠盐摄入量增加，甚至摄入过量的现象，原因是肉制品是食物中脂肪和食盐的重要来源，而人们对肉制品的逐渐需求量增加[5-7]。许多研究表明，高盐摄入是引发高血压和心血管疾病的重要因素[5-6]。因此减盐的同时保证产品理化特性和感官品质成为国内外学者的研究热点。

目前常用来替代食盐的有钾盐、钙盐和镁盐等[8]。氯化钾（potassium chloride，KCl）与氯化钠（sodium chloride，NaCl）性质相近，并且还未发现钾摄入与高血压的发病有直接关联[6]，因此是目前使用最广泛的替代盐。Wu等[9]分别用40%和70%氯化钾替代干腌熏肉中的氯化钠，发现使用氯化钾替代氯化钠对蛋白的降解没有显著影响；钙盐也是肉制品中常用的替代盐，钙不仅是人体骨骼的主要成分，也在维持细胞功能等方面有作用[10]。Horita等[11]发现氯化钙（calcium chloride，CaCl2）的添加降低了意式肉肠的乳液稳定性、蒸煮率、弹性和粘黏性，而使硬度增加。除此之外，镁盐也常用作肉制品中氯化钠的替代物[12]。由于钾盐的大量替代氯化钠会给产品带来苦味和金属味[13]，导致单一替代盐的使用存在一定局限性，因此国内外学者将研究重点转向多种食盐替代物和风味增强剂混合使用降低食盐添加量。风味增强剂本身不具有咸味，而是通过增强口腔器官对咸味的感知，来弥补减盐带来的咸味下降[14]。常用的风味增强剂有氨基酸类、核苷酸盐类、咸味肽、酵母提取物等。甘氨酸（glycine, Gly）是一种风味增强剂，通常用于加工肉类调味料的制备，具有缓和酸味、掩盖苦味，促进香味物质形成以及防腐功能[15-17]，因此在制作发酵香肠的过程中，可以通过加入甘氨酸来掩盖氯化钾带来的苦味和发酵产生的过度酸味，以达到加强风味的目的[18]。

本研究以发酵香肠为原料，使用氯化钾、氯化钙和甘氨酸三种替代盐替代香肠中的氯化钠，结合感官评价、质构特性、水分含量综合结果研究三种替代盐对发酵香肠的影响，并以此为基础利用响应面法进一步优化，得到发酵香肠替代盐的最佳替代比例，以得到适合添加在发酵香肠中的低钠复配盐，在保证香肠品质的基础上降低钠含量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌L.plantarumCD 101（NCBI编号为MG798695）、模仿葡萄球菌S.simulansNJ 201（NCBI编号为MG798688） 菌种由实验室分离鉴定获得；猪后腿肉、猪背膘、猪肠衣、白胡椒粉、姜粉、五香粉

南京苏果超市；食盐、葡萄糖 南通奥凯生物技术开发有限公司；异抗坏血酸钠 郑州拓洋实业有限公司；亚硝酸钠 杭州龙山化工有限公司；MRS Brouth培养基、MRS Agar培养基、TSA培养基、TSB培养基 北京路桥技术股份有限公司；氯化钾、氯化钙、甘氨酸 河南豫中生物工程有限公司；实验试剂 均为分析纯。

TC 12E绞肉机 意大利Sirman公司；VF608灌肠机、真空搅拌机 德国Handtmann公司；KBF

240恒温恒湿箱 德国Binder公司；质构仪 英国Stable Micro Systems公司；HVE-50自动高压灭菌锅 日本Hirayama公司；SW-CJ-1F超净工作台苏净集团苏州安泰公司；TS-5000Z电子舌 日本Insent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵剂的活化与制备L.plantarumCD 101的培养条件为37 ℃培养24 h；S.simulansNJ 201的培养条件为30 ℃培养24 h；分别活化3次后，取出浓度为107CFU/g的菌液，进行离心（10000×g，10 min，4 ℃），保留沉淀，加入适量无菌水进行离心洗涤，重复3次，最后重悬备用。

1.2.2 发酵香肠的制作 参考曹辰辰等[19]的方法，制作发酵香肠。基础配方为：8份新鲜猪瘦肉与2份猪背膘混合，调味料以肉重为计算，添加量分别为蔗糖1%、葡萄糖1%、亚硝酸钠0.015%、异抗坏血酸钠0.05%、姜粉0.1%、五香粉0.1%、白胡椒粉0.1%，两种发酵剂的菌液浓度均为107CFU/g。食盐含量根据试验设计添加，其中对照组食盐为2%。

工艺流程：原料肉处理→绞肉→加入调料→低温腌制→接菌搅拌→灌肠→恒温发酵→干燥成熟

工艺要点：剔除猪后腿瘦肉中的筋膜，切成均匀长条状，漂洗后4 ℃冷藏待用；猪背膘切成长薄片，贴至盆壁方便取出，放置于-20 ℃预冻待用。绞肉机选择孔径为10 mm的筛板，将瘦肉和背膘肉分别搅碎后，根据质量比8:2混合。按照比例加入各种调味料和辅料并搅拌均匀，置于4 ℃腌制24 h。加入提前活化的发酵剂，搅拌均匀后进行灌肠。灌肠直径约为3.5 cm，灌肠时要掌握合适的松紧度，既不能灌得过于饱满而胀破肠衣，也不能灌得过松导致肠体松散。发酵及干燥条件为：30 ℃、相对湿度80%快速发酵24 h；15 ℃、相对湿度75%缓慢发酵3 d；12 ℃、相对湿度72%干燥；以灌肠完毕为0 d，干燥后熟至第21 d得到发酵香肠成品。

1.2.3 单因素实验 以感官评价、质构、水分含量为评价指标，探究氯化钾、氯化钙和甘氨酸的不同替代量（以食盐添加量2%计算）对发酵香肠的影响，确定三种替代盐的最佳添加量，单因素实验中各因素的替代水平如表1所示。

表1 单因素实验中各因素水平设计Table 1 Levels of independent variables used for single factor test

1.2.4 响应面试验设计 结合单因素实验结果，选择每个因素的最佳替代比，采用Design-Expert 8.06软件，根据Box-Behnken中心组合设计原理，将感官评价和咸度值作为响应值，进行3因素3水平共17个点响应面优化试验，确定发酵香肠中替代盐的最佳替代比。因素与水平见表2。

表2 响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface design

1.2.5 感官评价 感官评价参照曹辰辰[19]的方法稍作修改。感官评价小组由14名经验丰富的食品专业人员（7男7女）组成，培训方法按照GB/T 22210-2008《肉与肉制品感官评定规范》[20]进行。如表3所示，感官评价分为颜色（20%）、气味（20%）、组织状态（30%）以及滋味（30%）4个部分，评判标准见表2。

表3 发酵香肠感官评分标准Table 3 Criteria for sensory evaluation of fermented sausages

1.2.6 质构分析 将发酵香肠切成高约为10 mm的圆柱，去除肠衣。使用P50 A探头，测定参数为：50 kg load cell，测前速度为2 mm/s，测试速度为5 mm/s，测后速度为2 mm/s，压缩率为50%。测定结果选取硬度、内聚性、弹性和咀嚼性进行分析[21]。

1.2.7 水分含量 按照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》测定[22]。

1.2.8 电子舌分析 参考巩洋[23]的方法略有调整。称取（10.0±1.0）g发酵香肠肉糜与200 mL去离子水充分搅拌均匀，超声处理15 min。使用纱布及滤纸过滤后，取约80 mL滤液进行电子舌分析。使用电子舌味觉分析系统，每个样品数据采集进行4次，第一组数据舍去。本实验选取咸度值进行分析。

1.3 数据处理

每个处理设置3个重复，采用Design-Expert 8.06软件进行响应面试验设计与分析，采用SAS 9.1软件中的Duncan’s Multiple-Range Test进行数据的显著性分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 氯化钾替代比对发酵香肠的影响

2.1.1.1 氯化钾替代比对发酵香肠感官评价的影响

如表4所示，随着氯化钾替代比例的增加，发酵香肠的颜色、气味、组织状态、滋味和总分均呈现先增加后减少的趋势。当氯化钾替代比例为40%时，产品组织状态得分显著降低（P＜0.05），这与Marcio等[24]的研究结果一致，并且此时发酵香肠出现苦味。当替代比为50%时，感官评价总分显著降低（P＜0.05），苦味和金属味显著，Wu等[9]也有相同的发现。综合各个指标，选择30%为氯化钾最佳替代比例。

表4 氯化钾替代比对发酵香肠感官评价的影响（分）Table 4 Effect of KCl substitution on sensory score of fermented sausages (scores)

2.1.1.2 氯化钾替代比对发酵香肠质构的影响 如表5所示，随着氯化钾替代量的增加，产品的硬度、弹性、内聚性和咀嚼性呈现先增加后降低的趋势，这与Wu等[9]的研究结果类似。30%替代组的硬度显著高于其他替代组（P＜0.05），与20%替代组无显著差异（P＞0.05）；30%替代组的内聚性和硬度显著高于其他替代组（P＜0.05）。硬度和内聚性是表征香肠切片性的重要特征[25]，根据实验结果可知，30%替代组的切片性最好，同时咀嚼性最好，这与感官评价结果一致，说明质构结果与感官评价之间存在良好相关性，避免了感官评价过程中的主观性影响。因此选择30%作为氯化钾的最佳替代比例。

表5 氯化钾替代比对发酵香肠质构特性的影响Table 5 Effect of KCl substitution on textural properties of fermented sausages

2.1.1.3 氯化钾替代比对发酵香肠水分含量的影响

如图1所示，经过发酵成熟，所有组别的发酵香肠水分含量均降低到30%以下，低水分含量有利于抑制发酵香肠中微生物的活动，更有利于香肠贮藏[26]。在本实验中，替代组的水分含量变化趋势为先增加后下降，这与宗丽娜等[27]的研究结果相似。当氯化钾替代比例增加到30%时，水分含量显著下降（P＜0.05），原因是氯化钠可以促进肌肉蛋白水解，使得肌原纤维束膨胀，从而导致肌原纤维之间的结构更加疏松，有提高持水性的功能[28]，当氯化钠被大量替代时，水分含量会降低。30%～50%替代组的水分含量之间无显著差异（P＞0.05），但综合3个指标的结果，选择使用30%氯化钾替代氯化钠的综合效果最佳。

图1 氯化钾替代比对发酵香肠水分含量的影响Fig.1 Effect of KCl substitution on water content of fermented sausages

2.1.2 氯化钙替代比对发酵香肠的影响

2.1.2.1 氯化钙替代比对发酵香肠感官评价的影响

如表6所示，随着替代量的增加，发酵香肠的颜色、气味、组织状态、滋味和总分呈现下降趋势。根据实验结果可知，10%替代组的颜色、组织状态、滋味和总分均显著高于其他替代组（P＜0.05），这与Gap等[29]用研究结果相似，其发现氯化钙替代低脂猪肉乳化肠中的氯化钠时，香肠的整体接受度与氯化钙的替代量呈反比。因此选择10%为氯化钙对最佳替代比例。

需要注意的是思维导图的制作应当根据学期授课安排，围绕教学目标，紧扣教学大纲，根据学生实际情况，合理安排章节，突出教学的重点和难点，并充分挖掘无机化学与药学专业的紧密联系。

表6 氯化钙替代比对发酵香肠感官评价的影响（分）Table 6 Effect of CaCl2 substitution on sensory score of fermented sausages (scores)

2.1.2.2 氯化钙替代比对发酵香肠质构的影响 由表7可知，随着氯化钙替代量的增加，产品的硬度、弹性、内聚性以及咀嚼性呈现先减小后增大的趋势，这与姚峥[30]的研究结果相似。根据实验结果，替代组的弹性均高于对照组，说明氯化钙可以提高产品弹性，但各替代组之间弹性没有显著区别，这与Alfonso等[31]的研究结果相似；10%替代组的硬度、内聚性和咀嚼性高于其他处理组，所以形成的切片状态和感官评分最佳，因此选择10%作为氯化钙的最佳替代比。

表7 氯化钙替代比对发酵香肠质构的影响Table 7 Effect of CaCl2 substitution on textural properties of fermented sausages

2.1.2.3 氯化钙替代比对发酵香肠水分含量的影响

如图2所示，各替代组水分含量逐渐增加，均高于对照组，原因是氯化钙使离子强度增强，亲水蛋白之间的作用力增大，结合了更多自由水使水分含量增加[32]。产品含水量与产品的弹性有关，水分含量越高，弹性越大[31]，这也验证了质构分析中替代组弹性高于对照组的结果。有报道表明氯化钙适宜用较小比例替代乳化肠中的氯化钠[29]，综合感官评分、质构和水分含量的结果，选择10%为氯化钙的最佳代替比例。

图2 氯化钙替代比对发酵香肠水分含量的影响Fig.2 Effect of CaCl2 substitution on water content of fermented sausages

2.1.3 甘氨酸替代比对发酵香肠的影响

2.1.3.1 甘氨酸替代比对发酵香肠感官评价的影响

如表8所示，甘氨酸替代量对气味没有显著影响（P＞0.05），但随着替代量的增加，发酵香肠的颜色、组织状态、滋味和总分降低。作为一种甜味剂，甘氨酸的加入适当减弱了发酵香肠的酸味，更加适合普遍消费者的口味，因此10%替代组的滋味得分最高，但当替代比增加到20%时，香肠滋味得分显著下降（P＜0.05），原因是发酵香肠的特殊风味被严重削弱，当替代比增加到40%，出现明显甜味，影响发酵香肠的感官品质，这说明甘氨酸在较小替代量时有加强香肠风味的作用，但替代量增大时反而会削弱发酵香肠的特殊风味，这与Gou等[33]的研究结果一致。综合各项指标得分，选择10%为甘氨酸的最佳替代比例。

表8 甘氨酸替代比对发酵香肠感官评价的影响（分）Table 8 Effect of Gly substitution on sensory score of fermented sausages (scores)

2.1.3.2 甘氨酸替代比对发酵香肠质构的影响 如表9所示，当甘氨酸替代量为10%时，产品质构特性均优于对照组，说明甘氨酸在一定程度上能够提高香肠的质构特性；但在各替代组之间，香肠的硬度、弹性、内聚性呈现逐渐降低趋势。10%替代组的硬度和内聚性最大，切片特性最好，并且咀嚼性最好，与感官评分结果相一致，说明质构测定与感官评价具有良好相关性。选择10%为甘氨酸的最佳替代比例。

表9 甘氨酸替代比对发酵香肠质构的影响Table 9 Effect of Gly substitution on textural properties of fermented sausages

2.1.3.3 甘氨酸替代比对发酵香肠水分含量的影响

如图3所示，随着替代量的增加，分水含量呈现先增加后减少的趋势。10%和50%替代组的水分含量与对照组接近且无显著差异，20%～40%替代组水分含量显著高于对照组（P＜0.05），水分含量的变化可能是由于甘氨酸影响了香肠的pH，使得蛋白质之间的静电斥力改变，纤维间距改变，从而蛋白和水的相互作用改变，引起香肠保水性的变化[25]。前人研究表明，甘氨酸单一替代的适宜比例为10%～20%[34-35]，因此选择10%为甘氨酸的最佳替代比例。

图3 甘氨酸替代比对发酵香肠水分含量的影响Fig.3 Effect of Gly substitution on water content of fermented sausages

2.2 响应面试验结果

根据Design-Expert V8.0.6软件中的Box-Behnken中心组合设计原理，以单因素实验得出的最佳替代比为基础，以A氯化钾替代比（%）、B氯化钙替代比（%）和C甘氨酸替代比（%）为自变量，以感官评价和咸度值为响应指标设计试验，既可以参考消费者的喜好感受，同时使用电子舌直观地表示出各个组合的咸度值大小，避免感官评价带来的主观性影响。试验组合及结果如表10所示。

表10 响应面试验设计方案及结果Table 10 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.1 响应面优化试验结果及方差分析 利用Design-Expert软件对感官评分及咸度值的实验结果进行拟合分析后，得到的结果如表10所示。

对感官评分结果进行拟合分析后，得到的二次多项方程为：Y=84.54-0.76A-3.28B-1.34C-0.80AB-1.37AC-0.073BC-3.32A2-2.51B2-1.36C2。R2=0.9325，校正系数R2Adj=0.8457，说明该试验具有较好拟合性，实验误差小，对样品感官评分的预测准确性高。感官评分的回归方差分析结果如表11所示，模型极显著（P＜0.01），且失拟项不显著（P＞0.05），说明模型有效可用。通过F检验可知，三种因素对发酵香肠的感官评分影响顺序为：B（氯化钙替代比）＞C（甘氨酸替代比）＞A（氯化钾替代比），并且一次项B和二次型A2、B2对模型极显著（P＜0.01），一次项C对模型影响显著（P＜0.05）。

表11 感官评分的回归方程方差分析结果Table 11 Analysis of variance for sensory score

对咸度值进行拟合分析后，得到的二次多项方程为：Y=2.41-0.19A-0.22B-0.45C+0.14AB+0.22AC+0.032BC-0.58A2-0.33B2+9.000E-003C2。R2=0.9089，校正系数R2Adj=0.7919，说明该试验具有良好拟合性，误差较小，可以对样品的咸度值进行预测。咸度值的回归方差分析结果如表12所示，模型极显著（P＜0.01）、失拟项不显著（P＞0.05），说明模型有效可用。通过F检验可知，三种因素对发酵香肠的感官评分影响顺序为：C（甘氨酸替代比）＞B（氯化钙替代比）＞A（氯化钾替代比），并且一次项C和二次型A2对模型极显著（P＜0.01），一次项B、二次项B2对模型影响显著（P＜0.05）。

表12 咸度值的回归方程方差分析结果Table 12 Analysis of variance for salinity value

2.2.2 各因素间的交互作用分析 利用软件对结果进行拟合分析后，得到响应面图如图4所示。三维曲面图的弧度可以说明因素对响应指标的影响程度，弧度越大，影响越大[35]。如图4所示，各因素之间有不同程度的交互作用，氯化钾和甘氨酸的交互作用最强，其次是氯化钾和氯化钙的交互作用，氯化钙和甘氨酸的交互作用对感官评分的影响最弱，这与方差分析的结果相符。感官评分随着氯化钾、氯化钙和甘氨酸替代比的增加呈现先增加后下降的趋势。各因素间交互作用对咸度值的影响如图5所示，钾化钙和甘氨酸的交互作用最强，其次是氯化钾和氯化钙，氯化钙和甘氨酸之间的交互作用最弱。

图4 各因素交互作用对感官评分影响的响应面图Fig.4 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on sensory score

图5 各因素交互作用对咸度值影响的响应面图Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on salinity value

综上所述，按照咸度值和感官评分最高为优化条件，利用软件进行优化，得到各替代盐替代发酵香肠中氯化钠的最佳替代比例为：氯化钾29.75%、氯化钙7.13%、甘氨酸5.40%，预测感官得分为85.61，咸度值2.88。

2.2.3 验证试验 考虑到实际生产的可操作性，调整参数为：氯化钾30%、氯化钙7%、甘氨酸5%（以对照组食盐重计算），以2%氯化钠为对照，重复3次进行验证。最终得到产品的感官评分平均值为85.37，咸度值平均值为2.90，均与模型理论值相近，说明该模型能够对实际值进行预测，应用于发酵香肠替代盐配方的优化。

3 结论

本实验通过感官评价、质构特性和水分含量的结果探究氯化钾、氯化钙、甘氨酸以不同比例替代氯化钠时对发酵香肠品质的影响。根据单因素实验，得到三种替代盐的最佳替代比例分别为：氯化钾30%、氯化钙10%、甘氨酸10%。在单因素实验基础上以感官评分和咸度值为响应指标进行响应面优化试验，以减少单一替代盐对发酵香肠品质造成的负面影响，最终得到发酵香肠低钠复配盐的最佳替代配方为：氯化钾30%、氯化钙7%、甘氨酸5%，此时模型预测预测感官得分为85.61，咸度值2.88。验证试验表明，此条件下发酵香肠感官评分为85.37，咸度值为2.90，钠含量为798.05 mmol/L，比对照组的1244.79 mmol/L降低了35.89%，说明本实验建立的模型能够较好的应用于发酵香肠低钠复配盐的开发，使用该低钠复配盐制作发酵香肠，不仅可以降低钠含量，还可以保持发酵香肠的感官品质，从而为发酵香肠的生产提供更健康的新工艺，开发满足不同人群需求的发酵香肠产品。