富顺香辣酱生产环境食源性致病细菌的分析及溯源分析

袁先铃，张洲铕, ，袁玉梅，王俊丁，雷 鸣

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川自贡 643000；2.四川省远达集团富顺县美乐食品有限公司，四川自贡 643200）

富顺香辣酱是挑选优质原辅料经过预处理、加工、酱体调配、杀菌、罐装最后再进行包装而成的半固态复合调味料[1]，属于一种非发酵类辣椒酱，与发酵类辣椒酱不同，香辣酱通常与各种肉制品、蔬菜和食用菌等搭配形成不同风味的调味食品[2-4]。香辣酱具有浓郁鲜香、温中健脾和增强食欲等特点[5-6]，畅销全国，甚至出口到南非和日本等国家，近几年的产值和销售额也在不断递增。

食源性致病菌是诱发食品安全问题的重要隐患[7]，致病性细菌直接或间接污染产品，从而造成香辣酱出现变色、胀气等腐败现象，人感染后可导致肠道传染病及食物中毒的发生并导致畜禽传染病的流行[8-9]。刘洋等[10]研究发现辣椒酱在自然发酵前期的主要优势菌是肠杆菌属；研究者Estrada-garcia等[11]对市售辣椒酱调查发现，5%的样本含有大肠埃希氏菌（Escherichia coli）。因此对香辣酱生产过程中的食源性致病菌进行研究显得尤为重要。

本研究以原料库房、粉碎车间、调配车间、罐装车间、机器设备表面、生产人员等与香辣酱直接或间接的接触环境为研究对象，以菌落总数、肠杆菌科菌为目标指示菌，通过对香辣酱生产环境进行动态监控，确定肠杆菌科种类及其在生产过程中数量变化。对分离出食源性致病细菌，进行革兰氏染色、氧化酶实验、葡萄糖实验等生理生化鉴定和分子生物技术鉴定，确定其种属，并进行溯源分析，为香辣酱生产环境的污染情况风险控制提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

富顺香辣酱 采样于四川省自贡市富顺县远达集团美乐食品有限公司；平板计数琼脂（PCA）、氧化钠（分析纯）、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）、糖琼脂（VRBGA）、缓冲蛋白胨水（BPW）、营养琼脂（NA） 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

HX3002T电子天平 慈溪市天东衡器厂；LS-75HD立式压力蒸汽灭菌锅 江阴滨江医疗设备有限公司；101-3AB电热鼓风干燥箱 北京中兴伟业仪器有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台 杭州旭清科技有限公司；SHP-250E生化培养箱 上海培因实验仪器有限公司；PH100-2A41L-EP生物显微镜 深圳市润兴光学仪器有限公司；3730XL测序仪 美国ABI公司；Legend Micro17离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司；2720 thermal cycler PCR仪美国ABI公司；JY300C电泳仪、电泳槽、JY04S-3C凝胶成像仪 北京君意东方电泳设备有限公司；DFD-700水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司；L550板式离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 香辣酱生产工艺 富顺香辣酱生产工艺主要分为以下四个阶段：第一工段，原辅料的预处理，清选出各种杂质；第二工段，原辅料加工及粉碎，包括酱油和菜油的萃取；第三工段，在调配缸中投入辣椒酱胚，投入萃取酱油、香辛料，搅拌均匀后，投入调配用萃取油，搅拌均匀；第四工段，杀菌、罐装和包装。

1.2.2 采样方法

1.2.2.1 空气取样 将营养琼脂（NA）平板和结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）平板放到采样点，打开皿盖，暴露5 min。采样频次，以每班次生产为周期，在生产前、生产过程中2 h/次、生产结束时分别采样，检测生产过程中菌落总数和肠杆菌现状及变化趋势。具体采样点要求按GB/T 18204.3-2013《公共场所卫生检验方法》（第3部分：空气微生物）进行操作：A：室内面积大于50 m2以上的设置5个采样点；B：采样点按均匀分布原则将采样的平板放置在生产线上；C：采样点与地面距离1.2～1.5 m，与墙壁距离应大于或等于1 m；D：应避免将通风口、通风道等作为采样点。

1.2.2.2 涂抹取样 用经杀菌后蘸有无菌生理盐水棉球擦拭取样框内表面（框内面积为50 cm2），擦完后将棉球放入盛有10 mL无菌生理盐水的试管中，此试管中溶液每mL代表5 cm2，密封带回微生物室备用[12]。

1.2.2.3 环境监控点及采样方式 环境监控点为：原料库房；粉碎车间；调配车间；罐装车间；生产人员及机器设备。其中原料库房、粉碎车间、调配车间和罐装车间采用空气采样的方式，生产人员和机器设备采用涂抹取样的方式。

1.2.3 菌落计数与空气菌群密度的换算 先直接数出培养皿中的菌落数目，再通过奥梅梁斯基公式（Omeilianski）将单位CFU/皿转换为CFU/m³。奥梅梁斯基认为，在100 cm2表面积的培养皿上5 min内沉降的菌群总数等同于10 L空气内的菌群总数[13]。

式中：X—每m³空气中的细菌数，CFU/m3；N—培养皿内菌落数，CFU /皿；r—培养皿半径，cm。

1.2.4 环境监控试验方法 菌落总数：将采集细菌后的营养琼脂平皿置于35～37 ℃培养48 h，菌落计数[14]；肠杆菌科：将采集细菌后的结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂平皿置于35～37 ℃培养24 h，菌落计数[15]。

1.2.5 生理生化鉴定 革兰氏染色：依次对细菌进行涂菌、初染、媒染、脱色、复染，然后在显微镜下观察菌落的颜色和形态并记录；氧化酶实验：用铂/铱接种环或玻璃棒挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂的滤纸上，若滤纸的颜色在10 s内变成蓝紫色，则判为阳性反应，反之则为阴性；葡萄糖实验：用接种针挑取少许氧化酶试验结果为阴性的同一个菌落，穿刺于葡萄糖琼脂内，于36±1 ℃培养。24±2 h后，若试管内的内容物变为黄色，则判为阳性反应，反之则为阴性。

1.2.6 菌种鉴定 将经过分离纯化后保存的菌株送成都擎科公司进行16S rDNA分子测序；对获得的序列 用NCBI（http://gffiy6dccdd7b6fe04693svubbvwq 6oop06n5n.fffb.suse.cwkeji.cn:999/）中的BLAST进行同源性比较[16]，从BLAST比对结果中找出最相似序列；结合生理生化实验和分子生物学鉴定结果，确定菌的种。利用MEGA6.0软件构建系统发育树，分析同源关系较近的菌株。

1.3 数据处理

应用SPSS Statistics 21.0软件对实验数据进行数据分析。采用Duncan法进行显著性分析，结果表示为平均值±标准差。

模型构建。根据以上分析，本文以碳排放数量为因变量，以碳交易金额和地区生产总值为自变量，建立二元线性回归模型，方程如下

2 结果与分析

2.1 检测结果

2.1.1 各生产车间肠杆菌科菌及菌落总数测定结果

生产过程中，对原料库房、粉碎车间、调配车间、罐装车间菌落总数和肠杆菌科菌落数量变化进行监测，测定结果如表1、表2所示。

由表1、表2相比可知，肠杆菌科疑似菌的菌群密度均远小于菌落总数菌群密度；由表1可知，原料库房每个时间段的菌落总数都达到了多不可记的程度，可能是原料库房通风性好，人员流动也相对频繁等原因所导致，并且原辅料进入原料库房也会携带大量的菌，贺稚非等[17]研究发现辣椒表面优势菌是细菌，其达到了3.40×107CFU/g。粉碎车间与调配车间相比，除了4 h，其余各时间段调配车间的菌群密度与粉碎车间的菌群密度相比都是显著降低（P＜0.05），可能是因为调配车间机械化程度高，管道较多，无鼓风设备，生产人员较少，故空气中微生物较少，洁净度[18]一直处于较高水平，并且在2和6 h时与罐装车间相比并无显著性差异（P＞0.05）。整体上，各车间空气菌群密度由低到高分别为：罐装车间＜调配车间＜粉碎车间＜原料库房。

粉碎车间、调配车间和罐装车间的菌群密度在生产前期（0～2 h）显著增加（P＜0.05），说明车间开始生产后可能由于人员活动和机器运转导致原辅料和地面上微生物浮游在空气中，导致空气洁净度降低。粉碎车间和调配车间的菌群密度在生产后期（8～10 h）显著降低（P＜0.05），说明生产完成后空气中的微生物逐渐减少，空气等级提高。由表1、表2可知，罐装车间空气采样菌群密度平均为5.51×102CFU/m³，且肠杆菌科菌监测值为0，略低于徐廷弼等[19]在某辣椒酱厂包装车间测得好氧菌的菌群密度8.2×102CFU/m³，可能是因为其包装车间只采用了紫外杀菌和定期消毒的方式，而本研究中的罐装车间在上述杀菌基础上额外增加了臭氧杀菌的方式。

表1 富顺香辣酱生产过程环境中菌群密度变化情况Table 1 Changes of bacterial density in the environment during the production of Fushun spicy sauce

表2 富顺香辣酱生产过程中环境中肠杆菌科菌群密度变化情况Table 2 Changes in the density of Enterobacteriaceae in the environment during the production of Fushun spicy sauce

罐装车间由于为生产最后环节，生产人员进入车间前需要经过清洁间、风淋室等以达到尽量减少人员带入菌的可能性，且罐装车间为一个比较封闭独立的空间，故罐装车间空气中肠杆菌科菌和菌总量均较少。

2.1.2 设备肠杆菌科菌测定结果 如表3所示，罐装车间设备表面及设备与食品接触面肠杆菌科菌均未检出肠杆菌科菌，这可能是因为人员进入罐装车间需经过清洁间、风淋室，罐装车间空间相对封闭独立且人员管理良好，故罐装车间空气洁净等级比较高，微生物含量少。

表3 富顺香辣酱罐装车间设备肠杆菌科菌测定结果Table 3 Detection results of Enterobacteriaceae in equipment of Fushun spicy sauce canned workshop

2.1.3 生产人员肠杆菌科菌测定结果 如表4所示，罐装车间生产人员在清洁前，只有2#生产人员带有肠杆菌科菌，但清洁后，检测结果为0，说明清洁方法能有效杀菌。罐装人员在完成清洁后人员手部均未携带肠杆菌科菌，工作5 h后有一人携带了肠杆菌科菌，其余2人均未携带肠杆菌科菌，这可能与个人操作有关，或者生产结束后与鼻腔等接触有关。

表4 富顺香辣酱罐装车间生产人员肠杆菌科菌测定结果Table 4 Detection results of Enterobacteriaceae of production personnel in Fushun spicy sauce canned workshop

2.2 肠杆菌科鉴定结果

2.2.1 理化鉴定结果

2.2.1.1 生理生化鉴定结果 根据表5中生理生化鉴定结果，参考《伯杰细菌鉴定手册》[20]，初步鉴定除菌株F2和D2外，其余菌株皆为肠杆菌科的细菌。

表5 车间和人员肠杆菌科疑似菌鉴定结果Table 5 Identification results of suspected Enterobacteriaceae strains in workshop and personnel

2.2.1.2 分子生物学鉴定结果 部分肠杆菌科疑似菌16S rDNA序列PCR扩增电泳图如图1所示；可知8条亮带均在1500 bp左右位置出现，并且无明显非特异扩增现象，符合测序要求。

图1 部分代表性肠杆菌科疑似菌16S rDNA序列PCR扩增序列电泳图Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified sequence of 16S rDNA of some representative Enterobacteriaceae suspected bacteria

将条带清晰的PCR 扩增产物进行测序，测序结果经NCBI比对，确定各菌株的分类地位。结果如表6所示。

对香辣酱各生产车间、生产人员检测出的菌种进行分离纯化经16S rDNA测序后与Genbank中数据做相似性分析的结果如表6所示，由表分析可知，分离出14株菌株，致病菌占13株。其中斯氏普罗威登斯菌（Providencia stuartii）[20]、奥斯勒莫拉氏菌（Moraxella osloensis）[21]、香坊肠杆菌（Enterobacter xiangfangensis）[22]、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）[23]为肠杆菌科致病细菌；2株不动杆菌属（Acinetobactersp.）[24]、2株鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）[25]、阿尔塔米拉金色单胞菌（Aureimonas altamirensis）[26]、栖麦假单胞菌（Pseudomonas oryzihabitans）[27]、绿脓杆菌（Pseudomonas baetica）[28]、粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）[29]均为致病细菌；红绶曲霉（Aspergillus nomius）[30]为致病菌；根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）[31]为非致病菌。

表6 车间和人员肠杆菌科疑似菌16S rDNA同源性对比Table 6 16S rDNA homology comparison of suspected Enterobacteriaceae bacteria in workshop and personnel

研究表明，徐廷弼等[19]在某辣椒酱各车间分离到葡萄球菌、克雷伯氏杆菌、阴沟肠杆菌，与本研究结果基本相符；在部分药品企业车间检出不动杆菌属、普罗维登斯菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等[32]，说明调味品与药品的生产车间细菌类群具有一定相似性。

2.3 溯源分析

将生产环境中鉴定出的菌种利用聚类分析软件MEGA 6.0进行聚类分析，采用邻位相连法（Neighbour-Joining）建立生产环境中菌种的系统发育树，如图2：

图2 用邻近法基于16S rDNA序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree inferred by neighbor-joining method based on 16S rDNA sequences

通过对整个系统发育树观察可知，调配车间分离出的菌与粉碎车间和罐装车间分离出的菌都具有较高的同源性，可能是因为调配车间为生产工艺的中间环节，且粉碎车间和调配车间分布结构为上下结构且有人员流动。从上面的大分支看可知，Aureimonasaltamirensis是上面分支最原始的菌，且该菌分离于原料库房，由此看出整个工艺流程的车间环境都与原料库房有关；Krizova等[33]研究发现不动杆菌属广泛存在于土壤和水系统中，而原料库房与外界环境联系最紧密，与在原料库房中分离出不动杆菌属的结果相符，生产人员手上分离出的3株菌与原料库房的菌同属于不动杆菌属，而生产人员进入车间前经过严格的消毒杀菌和验证消毒，说明生产人员所携带的菌来源于原辅料；另外生产人员手上还分离出Klebsiella pneumoniae，该菌与粉碎车间的Moraxella osloensis在同一分支上，但自展值较低，意义不大；罐装车间的Alcaligenes faecali与上述两种菌的自展值也较低。综上可知，肠杆菌科菌可能存在于原料库房、粉碎车间、调配车间、生产人员等环节。原料库房、粉碎车间、调配车间空气环境中存在交叉污染现象；罐装车间和调配车间存在同源性较高的致病菌，推测可能因为人员流动和人员清洁不彻底或频率不达标造成了交叉污染[34]。

3 结论与展望

通过对香辣酱生产环境（包括原料库房、粉碎车间、调配车间、罐装车间、设备和生产人员）进行动态监控和微生物的培养，分离出食源性致病菌，结合传统的生理生化鉴定和分子生物技术进行鉴定和溯源分析。从监控结果来看，各车间整体清洁度由低到高分别为：原料库房＜粉碎车间＜调配车间＜罐装车间。各个车间加工过程中清洁度由生产前较低到生产过程中高再随着生产结束逐渐降低。肠杆菌科疑似菌的菌群密度均远小于菌落总数菌群密度，原料库房空气中最多，数量随着生产开始逐渐增加，生产后2 h达到峰值，然后随着生产结束而减少；罐装车间空气中和设备表面的肠杆菌科菌监测值都为0。从鉴定结果看，各生产车间中均检出致病菌，分离出14株菌种中致病菌13株。通过溯源分析可以看出，原料库房、粉碎车间、调配车间、罐装车间空气环境中存在交叉污染现象，并且各个车间和生产人员分离出的菌与原料库房环境中的菌都具有较高同源性，由此可以推测出可能是原辅料中所带的菌随着生产工艺流程的推进，逐步污染了生产人员、粉碎车间、调配车间和罐装车间；也可能是人员流动和人员清洁不到位或频率不达标造成了交叉污染。

本研究丰富了香辣酱生产环境中食源性致病细菌数据库，为完善溯源系统和HACCP体系提供了理论基础。为健全体系，还需探明原辅料中的食源性致病细菌、原料库房的最优储存条件、最优防腐工艺和杀菌工艺，来提高香辣酱的食用安全性，为传统的香辣酱生产提供保障，实现食源性致病细菌风险的可防可控。