绣球菌中抑制α-葡萄糖苷酶活性组分的筛选及作用机理

吴 勇，王泽玉，周 娜，赵 福，赵佳山，李耘业，王 欣，李金杰

（北京联合大学，生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京 100191）

绣球菌（Sparassis crispa）属无褶菌目绣球菌科绣球菌属，主要分布在全球的北温带地区，生长在针叶树种的树桩上，是一种名贵珍稀药食两用的大型真菌[1]。该菌不仅味道鲜美，且具有多种营养和保健功能[2]。文献报道其提取物具有抑菌、降脂[3]、抗肿瘤[4]、增强造血功能、降压、降糖[5]、抗炎[6]和抗氧化等药理活性[7-9]。我国从80年代开始对绣球菌进行人工栽培，2005年栽培成功，目前已有6家工厂实现了规模化生产，日产约10万袋（220 g/袋）。但绣球菌目前在我国还主要用作食材，开发的产品仅有少量袋泡茶和保健食品[10]。我国对绣球菌中活性组分的研究和开发不足，严重制约了绣球菌高附加值利用和产业的发展。

随着世界人口老龄化加剧与人们生活方式的改变，我国糖尿病成人患病者已达1.198亿，预计到2045年全球糖尿病患者将达6.29亿[11]。糖尿病是人体产生和（或）利用胰岛素障碍、导致血糖升高的一种慢性疾病，可引起心脑疾病、失明、肾衰和下肢截肢等严重并发症[12-14]；其中，Ⅱ型糖尿病占所有类型糖尿病的90%以上[15-17]。目前，国内外对糖尿病没有根治的办法，降低餐后血糖是一个主要治疗措施。α-葡萄糖苷酶抑制剂是临床降低Ⅱ型糖尿病患者餐后血糖比较安全的一线药物之一，其主要药理机制是抑制小肠刷状缘上的α-葡萄糖苷酶活性而延缓碳水化合物的转化，从而降低餐后血糖；但长期服用仍有呕吐、恶心和肝肾损失等副作用[18-19]。因此，从无毒、易得、可大规模生产、具有降糖作用的可食用绣球菌中发现抑制α-葡萄糖苷酶的组分，将为开发出预防或延缓Ⅱ型糖尿病的功能食品提供科学的理论依据。

截至目前，尽管有绣球菌调节血糖、预防或治疗糖尿病的多项专利产品[20-23]，但降糖的基础研究报道却寥寥无几。仅有一篇文献报道了绣球菌提取物对高血糖大鼠的降糖功效[5]，还有一篇文献报道绣球菌中的2个脂肪酸类成分具有降糖作用[24]。但是，目前关于其主要降糖作用活性组分及其干预II型糖尿病的靶点机制缺乏整体系统研究，更未见其关于抑制α-葡萄糖苷酶的报道。因此，本项目以绣球菌为研究对象，经提取、萃取、大孔吸附树脂分离纯化分成不同极性的多个组分后，用体外抑制α-葡萄糖苷酶活性实验进行测试，明确抑制活性组分；再运用酶促动力学和Lineweaver-Burk双倒数法探讨最佳抑制活性组分的作用机制，为绣球菌的降糖功能产品开发及其后期质量检测提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绣球菌Sparassis crispa，山西农业大学刘靖宇教授提供；α-葡萄糖苷酶（100 U）、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG） 上海源叶生物科技有限公司；阿卡波糖 上海晶纯生化科技股份有限公司；HP-20型大孔吸附树脂 日本三菱公司；所有有机溶剂 均为分析纯，北京化工厂。

TRU-SWEEP D型超声波清洗器 美国CREST公司；Sartorius BP121s型电子天平 德国赛多利斯公司；Synergy H1型酶标仪 美国Biotek公司；R-215型旋转蒸发仪 瑞士Buchi公司；Milli-Q型制水机美国密理博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 绣球菌活性组分的提取 本实验设计了两组不同乙醇浓度的提取方法，一组选用95%、80%、65%这三个浓度梯度提取，这种方法能更为全面地将小极性、中等极性组分提取出来；另一组用50%恒浓度提取，主要用来提取大量的中等及大极性成分。具体方法：将干燥绣球菌用粉粹机粉碎后，过50目筛备用。称取上述粉末500 g两份，一份用95%、80%、65%乙醇依次超声提取，每种浓度提取1次，每次提取时间为90 min，超声功率为420 W，合并3次提取液，将其减压浓缩得到绣球菌提取物1（编号为HBR-1）；另一份用50%乙醇超声提取3次，每次提取时间为90 min，超声功率为420 W，合并3次提取液，将其减压浓缩得到绣球菌提取物2（编号为HBR-2）。

1.2.2 绣球菌提取物的初步萃取分离 将上述得到的提取物HBR-1和HBR-2超声，将其分散于水中后，每次加入500 mL乙酸乙酯，萃取3遍，每次40 min，得到乙酸乙酯相和水相。乙酸乙酯相减压浓缩蒸干，编号分别为HBR-1-Y和HBR-2-Y；将萃取后剩余水相用大孔吸附树脂分离纯化，依次用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇和95%乙醇洗脱，每个提取物分别获得五个组分，依次编号为HBR-1-1、HBR-1-2、HBR-1-3、HBR-1-4和HBR-1-5，HBR-2-1、HBR-2-2、HBR-2-3、HBR-2-4和HBR-2-5。

1.2.3 提取物、各组分抑制α-葡萄糖苷酶的活性测试 将1.2.1得到的两个粗提物和1.2.2得到的12个组分各称取5.0 mg左右，用pH7.0，200 mmol/L的PBS溶解，将总提取物HBR-1和HBR-2配成浓度为5 mg/mL，其余各组分配成0.5 mg/mL的待测液。活性测试采用4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷法（4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，PNPG法）[25]，整个实验在96孔板中进行，分为实验组、背景组、对照组和空白组。各组所加试剂见表1。每组都是将样品或PBS与α-葡萄糖苷酶在37 ℃恒温箱下培养15 min后，再加底物PNPG，混匀后再在37 ℃恒温箱下培养20 min，每孔加Na2CO3终止反应，用酶标仪在波长405 nm处测定OD值（A），每个样品设3个复孔，计算抑制率，公式如下：

表1 α-葡萄糖苷酶抑制试验反应体系（μL）Table 1 Reaction system of inhibition activity against α-glucosidase(μL)

式中：I表示抑制率，%；A对照表示对照组的吸光值；A空白表示空白组的吸光值；A实验表示实验组的吸光值；A背景表示背景组的吸光值。

1.2.4 抑制α-葡萄糖苷酶活性组分的IC50的测定将1.2.3筛选得到的活性比较好的组分（抑制率大于50%）分别称取5.0 mg左右，稀释5～6个浓度，按照1.2.3实验方法进行IC50的测定。

1.2.5 抑制α-葡萄糖苷酶活性组分的作用机制研究

将1.2.3筛选得到的活性比较好的组分（抑制率大于50%）进行抑制作用机制研究。根据参考文献[26-27]结合本实验室条件做适当调整，具体方法如下：固定PNPG浓度为2.0 mmol/L，HBR-1-4在浓度为0、0.1、0.2、0.4 mg/mL和HBR-2-4浓度为0、0.04、0.08、0.12 mg/mL的情况下，测定不同α-葡萄糖苷酶浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 U/mL）时的酶促反应初速率作图。用酶浓度（U/mL）做横坐标，反应初速度（mmol/L·min）做纵坐标，根据图的特征推断活性组分与α-葡萄糖苷酶的结合方式；然后，固定α-葡萄糖苷酶浓度为0.2 U/mL，在HBR-1-4浓度为0、0.1、0.2、0.4 mg/mL和HBR-2-4浓度为0、0.04、0.08、0.12 mg/mL的情况下，测定不同PNPG 浓度（1、2、4、6、8 mmol/L）时的反应速率。用PNPG浓度的倒数（1/S）做横坐标，反应速率的倒数（1/V）做纵坐标，绘制Lineweaver-Burk曲线[28]，根据动力学参数（Vmax、Km）来推断活性组分对α-葡萄糖苷酶抑制类型。

1.3 数据处理

实验结果取三次平行实验的平均值，数据表示为Mean±SD，采用GraphPad Prism 5软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 绣球菌各组分抑制α-葡萄糖苷酶活性结果

两种不同浓度乙醇-水提取方法得到的提取物HBR-1和HBR-2及粗分得到的12个组分，进行抑制α-葡萄糖苷酶活性试验，结果见表2。结果表明，HBR-1和HBR-2抑制α-葡萄糖苷酶的活性均大于30%，HBR-2提取物活性稍强于HBR-1；各组分测试结果显示，大孔吸附树脂60%洗脱组分即HBR-1-4和HBR-2-4具有最强的抑制α-葡萄糖苷酶活性，抑制率分别是71.13%±0.05%和90.31%±0.02%，且HBR-2-4的抑制率与阿卡波糖相当。其余组分抑制率均小于20%，活性不明显。

表2 绣球菌不同极性组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性Table 2 α-Glucosidase inhibitory activity of different polar components of S. crispa

由此推测，绣球菌中大极性成分（HBR-1-1和HBR-2-1）含量可达22%以上，不是绣球菌中抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要成分；中等偏大极性部分（HBR-1-2、HBR-1-3和HBR-2-2、HBR-2-3）和中等偏小极性部分（HBR-1-Y、HBR-1-5和HBR-2-Y、HBR-2-5）活性效果也不明显，也不是绣球菌中的主要抑制活性组分；大孔吸附树脂60%乙醇洗脱部分（HBE-1-4和HBR-2-4）才是其中的主要抑制活性成分，这部分含量较少，仅占0.31%～0.35%，可见，绣球菌中抑制α-葡萄糖苷酶的活性物质是微量成分在起作用。

2.2 活性组分对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50

根据2.1实验结果，对其中有抑制活性的组分进行IC50的测定，即HBR-1-4和HBR-2-4。通过Graphpad软件拟合抑制曲线（见图1～图3），可以得出HBR-1-4、HBR-2-4和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50，结果如表3所示。由表3可知，用50%乙醇提取，大孔吸附树脂60%乙醇洗脱组分，即HBR-2-4抑制α-葡萄糖苷酶的活性最强，其IC50为0.0927±0.0600 mg/mL，与阿卡波糖（0.0795±0.0200 mg/mL）活性相当。

表3 绣球菌活性组分及阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50Table 3 IC50 of inhibition activity against α-glucosidase of active fractions and acarbose

图1 HBR-1-4的抑制曲线Fig.1 Inhibition curve of HBR-1-4

图3 阿卡波糖的抑制曲线Fig.3 Inhibition curve of acarbose

图2 HBR-2-4的抑制曲线Fig.2 Inhibition curve of HBR-2-4

2.3 活性组分对α-葡萄糖苷酶的抑制作用机制

酶促动力学结果显示，组分HBR-1-4（浓度为0、0.1、0.2和0.4 mg/mL）和HBR-2-4（浓度为0、0.04、0.08和0.12 mg/mL）的酶浓度-反应初速率图是一组近似通过原点的直线，并且加入样品的直线斜率全部小于未加样品的直线斜率，由此推断HBR-1-4和HBR-2-4与α-葡萄糖苷酶和（或）酶底物复合物是可逆性结合（见图4和图5）。

图4 HBR-1-4的酶浓度-反应初速率图Fig.4 Picture of enzyme concentration-initial velocity of HBR-1-4

图5 HBR-2-4的酶浓度-反应初速率图Fig.5 Picture of enzyme concentration-initial velocity of HBR-2-4

根据Lineweaver-Burk双倒数作图结果显示，组分HBR-1-4和HBR-2-4在不同浓度下，所有直线都与空白组相交于第二象限（见图6和图7）。通过图6和图7发现，随着各组分样品浓度的增加，米氏常数Km逐渐升高，而最大反应速率Vmax逐渐降低，具体抑制动力学参数见表4，这种现象根据文献[29-30]判断是竞争与非竞争的混合型抑制类型。因此，HBR-1-4和HBR-2-4对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用属于竞争与非竞争的混合型抑制类型。

表4 HBR-1-4和HBR-2-4对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学参数Table 4 Kinetic parameters of inhibition of α-glucosidase of HBR-1-4 and HBR-2-4

图6 HBR-1-4对α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲线Fig.6 Lineweaver-Burk curve of HBR-1-4 for inhibiting α-glucosidase

图7 HBR-2-4对α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲线Fig.7 Lineweaver-Burk curve of HBR-2-4 for inhibiting α-glucosidase

3 结论

本实验探讨了绣球菌不同极性组分对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及机制。体外酶活抑制实验表明，50%乙醇恒浓度超声提取3次比95%、80%、65%乙醇依次超声提取3次所得提取物的抑制活性稍强，但两种不同乙醇提取浓度得到的大孔吸附树脂60%乙醇洗脱组分HBR-1-4（IC50值0.2666±0.0500 mg/mL）和HBR-2-4（IC50值0.0927±0.0600 mg/mL）的抑制活性差别比较大，HBR-2-4活性接近于阿卡波糖（IC50值0.0795±0.0200 mg/mL）；同时，酶促动力学和Lineweaver-Burk双倒数法实验结果表明，活性组分的机制都是竞争与非竞争的混合型抑制类型。

综上所述，HBR-2-4抑制α-葡萄糖苷酶的活性结果提示，用50%乙醇恒浓度超声提取3次的提取方法比用3次不同浓度梯度提取的方法好；用上述提取和纯化方法得到的活性组分，具有开发成辅助降血糖的保健食品或药品的潜力。但这个组分成分复杂，发挥抑制作用的主要活性单体成分还未明确，因此，后期应重点对抑制组分的常量成分进行分离纯化、微/痕量亚组分进行液质分析，明确其活性组分的降糖物质基础；为绣球菌的开发利用提供可靠的科学依据。