野生酸枣黄酮乙醇提取工艺研究

李富强，寿晨莉，张悦瑶，程文璇，王梦姣，张 玲，张东芹，王报贵

(滨州学院生物与环境工程学院&山东省黄河三角洲生态环境重点实验室&山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心&滨州市食品安全重点实验室，山东 滨州 256603)

1 引言

酸枣(ZiziphusjujubaMill. var.spinosa(Bunge)Hu ex H .F. Chow)，鼠李科枣属植物，原产于长江以北的华北地区，中南地区也有分布，目前在全世界范围内种植，分布甚广，产量颇丰[1]。野生酸枣作为平性类植物之一，其所包含的黄酮类化合物具有安神、改善神经系统的药用价值，是一种很强的抗氧化剂，可有效中和体内的氧自由基，从而起到延缓细胞衰老、老化；也可以改善血液循环，降低胆固醇，从而大大降低心血管疾病的病发率[2]。

黄酮类化合物在药理、生物活性方面也有良好的活性，首先其有助于将炎性生物酶保留在体内，从而加快伤口的愈合速度，还有止痛的效果；其次因为具有强抗组织胺的特性，所以可用来治疗多种敏感性疾病[3]。有研究发现蚊子草中的部分黄酮提取物对NO、IL-6炎症因子的释放有显著的抑制作用，具有明显的抗炎活性。此外，相比于不喝绿茶的人，时常喝绿茶的人患心脏病的概率小了约1/2，致命性的更是仅有前者的1/3；其中重要的原因之一就是绿茶中所含的黄酮[4]。除此之外，黄酮在降低血糖、血压方面也具有极佳的效果，有相关结论表明，植物黄酮提取物均有不同程度降低血糖的能力，降低血清TC水平，升高SOD等水平，且其降低血糖能力与总黄酮含量有明显的正相关关系；同时其对血液流变学的相关指标也有不同程度的改善作用[5]。黄酮类化合物具有极强的抗氧化性，主要表现在它基于独特的化学结构能够减少自由基的生成同时具有中和自由基的能力，且黄酮中羟基的数量越多，其质子所具有的能力就更强，也就会提高其对氧化效果的对抗作用。研究表明：在新鲜果蔬中，如部分蔬菜类的黄酮提取物对Fe3+有不低的中和作用以及极高的中和DPPH等类似自由基的活性，且其中和强度在活性物质提高的情况下也会有相应的提高[6]。也有其他结论表明，黑果枸杞当中的黄铜提取物其在抗氧化能力方面已经明显优于抗坏血酸[7]。

目前发现，酸枣当中具有黄酮类物质，但未被充分利用，部分提取工艺尚不够完善[8，9]。因此本课题研究采用超声辅助乙醇提取工艺提取野生酸枣中黄酮的最佳提取工艺。总体目的是在单因素实验和正交试验的模型下，找出最优的提取工艺参数如时间、温度、料液比等，以期由此获得最好的提取方式，将会对酸枣中黄酮的利用最大化，为酸枣的综合利用提供一种切实可行的工艺，对未来对酸枣的开发和产业利用提供参考价值。

2 实验材料和方法

2.1 主要仪器与试剂

紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技中国有限公司)，红外干燥箱(上海景迈仪器设备有限公司)，海信(山东)冰箱， KQ-A1000DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，电子天平(上海菁海仪器有限公司)，JJ-2 组织捣碎机，酸枣(山西中晋元农贸有限公司)，无水乙醇(烟台远东精细化工有限公司)，Rutin-芦丁标品(合肥博美生物科技有限责任公司)，硝酸铝(天津市福晨化学试剂厂)，亚硝酸钠(天津市福晨化学试剂厂)，氢氧化钠(天津市福晨化学试剂厂)。

2.2 实验方法

2.2.1 样品预处理

把清洗过的食品级酸枣去核处理，将果核上的果肉分离干净，用剪刀将果肉及果皮部分剪成小块状，平铺在清洗并烘干的托盘上，保持在45 ℃下，于红外干燥箱中烘干至重量不变，取出后进行粉碎处理，然后过40目筛，装入密封袋中，保存于4 ℃冰箱中备用[10]。

2.2.2 芦丁标准曲线的绘制

首先配制0.2 mg/mL的标准母液，并以其作为对照。步骤为：准确称量芦丁标准品(20.00 mg)，于恒温(40 ℃)水浴下使用乙醇进行溶解，而后在室温下定容于50 mL的烧杯中、震荡摇匀后备用。将芦丁标准母液用5 mL的移液管分别吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL至预先准备好的25 mL具塞试管中，同时做一组空白对照，首先加入配制好的浓度为5%的亚硝酸钠溶液1.5 mL，摇匀，静置6 min，接着加入浓度为10%的硝酸铝溶液1.5 mL，摇匀，静置6 min，再加入浓度为4%的氢氧化钠溶液7.5 mL，最后用相同浓度的乙醇浓度定容至25 mL，摇匀静置15 min[9]。以0 mL母液的对照组为参照，用紫外分光光度计的510nm处，测定各样品的OD值，每样平行测定3次取平均值，用每组样品计算出的芦丁标准母液浓度(x)为横轴，OD值(y)为纵轴绘制芦丁标曲。

2.2.3 黄铜的提取

准确称取1.0 g样品酸枣粉，放置于50 mL离心管中，加入相对应浓度和体积的浸取液乙醇，摇匀，使酸枣粉和乙醇溶液充分混匀，在适当的超声功率下提取一定时间的黄酮。将提取液置于高速冷冻离心机中，在4200 r/min条件下离心20 min后，取上清液并添加相应浓度提取液至体积相同，静置备用。

2.2.4 黄酮含量的测定

采用NaNO2-Al(NO3)-NaOH光度法检测总黄酮含量[8]。用1000 L移液枪吸取1mL备用样液于离心管中，再依次用相同规格移液枪精确添加NaNO2溶液、Al(NO3)溶液和NaOH溶液各0.4 mL，注意每次添加后均需进行震荡加静置步骤，时长分别为6 min、6 min和15 min，而后测定其OD510nm值，依照前一步绘制的芦丁曲线和公式(1)得出黄酮总量：

(1)

式(1)中：c为由芦丁标曲对应算出定容后待测样液中总黄酮的质量分数，mg/mL；n为稀释倍数；v为样液的总体积，mL；m为野生酸枣粉质量，mg。

2.3.5 单因素试验

单因素试验水平见表1。

表1 单因素试验水平

2.2.6 数据处理

各单因素及标曲实验数据均在Word整理，查阅相关文献确定各因素实验初步范围，确定单因素水平表，收集标曲和各单因素平行实验数据，在Prism中绘制折线图；参照单因素结果确定正交试验因素水平表，在SPSSAU网页中制作正交表；记录正交试验数据进行整理分析得出总黄酮得率最高的组合。

3 结果与讨论

3.1 芦丁标准曲线的绘制

由图1可以得出，芦丁标曲回归方程为：y=12.889x-0.0003，R2=0.9991，线性关系较好。

图1 芦丁标准曲线

3.2 单因素实验结果

3.2.1 乙醇浓度对总黄酮得率的影响结果

从图2可以发现，在提取剂浓度较低时，乙醇体积分数与总黄酮提取率成正相关，即随着体积分数逐渐增大，总黄酮提取率也逐渐升高，并在浓度为55%时达到峰值，但是，随着乙醇体积分数的继续增大，总黄酮提取率开始降低。出现这种曲线出现可能是55%乙醇的极性与酸枣粉中提取物的极性相差较小，所以，这种溶质与溶剂结构上的相似，导致提取物与提取液彼此互溶达到最大，也就表现为黄酮得率最高。因此乙醇浓度为55%是最适的提取浓度，并用于后续单因素试验。

图2 乙醇浓度对得率的影响

3.2.2 液固比对总黄酮得率的影响结果

由图3可知，当液固比处于5∶1至25∶1之间时，液体含量与黄酮得率成正比，即液体含量越多，黄铜得率就越大，并且液固比为25∶1所得率达到峰值(1.243%)，而当液固比升高到30∶1(mL/g)时出现下降趋势。由此可说明当浸取的体积液过低时，无法将样品当中的黄酮全部浸取出来，不能彻底溶出黄酮，因此随着浸取液的增多，浸取液更完全的浸取黄酮，当浸取液足够多时，酸枣粉当中绝大部分的黄酮能够被浸取，黄酮得率达到最高，当浸取液的用量继续增加时，可能会浸取出部分会影响黄酮显色反应及吸光度测定的杂质，或者会使部分黄酮发生变性，并且加入过量的浸取液会造成试剂的浪费，综上考虑，最佳液固比为25∶1(mL/g)，并用于后续单因素试验。

图3 液固比对得率的影响

3.2.3 超声时间对总黄酮得率的影响

由图4可知，超声时间处于20～40 min时，总黄酮得率与时长成正比，即时间越长，得率越大，直至40 min时到达峰值；随后，超声时间的延长致使总黄酮得率出现较大幅度降低。这种现象的原因可能是当时间短于20 min时，酸枣中黄酮浸取未达到饱和，得率较低；随着时间增加，黄酮化合物有充足的时间析出，得率随之上升。但当时间超过40 min之后，浸取液在较高温度下部分挥发，导致损失使得率下降；同时，较长时间处于较高温度下，黄酮类物质也容易被分解破坏，或者发挥抗氧化性而被分解，引入其它杂质，使得率下降。因此，全面考虑确定最佳超声时间为40 min，并用于后续单因素试验。

图4 超声时间对得率的影响

3.2.4 超声温度对总黄酮得率的影响

由图5可以看出，在40 ℃之前，随着超声温度的逐渐升高，总黄酮得率急剧升高，并在40 ℃时总黄酮的得率达到峰值，随后其随着超声温度的增加呈逐渐下降趋势。造成这种趋势的原因可能为，在40 ℃之前，温度对黄酮化合物的溶出起主导影响，随着超声温度的升高，分子热运动速度加快，混合溶液的粘性降低，使得浸取效率较高，当温度升高到30～50 ℃时，总黄酮的得率较为稳定，表明酸枣当中黄酮在这段温度区间较为稳定，浸取率较高且没有被大量破坏；当随着温度继续升高至50 ℃之后，表明温度对黄酮的黄酮类化合物的破坏作用已经较为严重，此时析出杂质的量也较高，使得率出现较大幅度的下降趋势。此外，综合考虑温度过高耗能和对浸取液挥发这一重要影响因素，确定最佳的超声温度为40 ℃，并用于后续单因素试验。

3.2.5 超声功率对总黄酮得率的影响

由图6可以看出，400～500 W总黄酮得率随着超声功率的升高出现缓慢的上升趋势，并在500 W超声功率达峰值，随后其随着超声功率的升高得率出现缓慢降低的趋势。出现这种趋势是因为，利用超声波辐射压强产生的强烈空化效应、机械振动、扰动效应、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速黄酮类化合物进入乙醇溶液，以此提高总黄酮得率。但随着超声功率的升高，总黄酮得率下降可能使其他杂质物质析出，影响黄酮化合物的溶出，确定最佳功率为500 W。

图5 超声温度对得率的影响

图6 超声功率对得率的影响

3.3 正交试验结果

参照3.2单因素试验所得出的试验数据及分析情况，选取对酸枣果肉及果皮黄酮得率影响作用更显著的因素(即乙醇浓度、液固比、超声温度和时间)，继续进行了正交试验，以优化超声波辅助浸取酸枣果皮和果肉中总黄酮的工艺参数，因超声功率影响较小，故综合耗能考虑选择超声功率400 W，正交试验结果见表2。

实验结果表明：在试验5中酸枣粉黄酮的得率达到最大值，最优组合为A2B2C3D1，此时酸枣果肉及果皮中黄酮得率可达1.447%。通过比较R值可以发现，各因素的影响程度顺序为A-乙醇浓度最显著，C-液固比较明显，D-超声温度次次，D-超声时间最弱，据此得到最佳提取因素是：乙醇浓度55%；超声时间40 min；液固比27∶1 (mL/g)；超声时间35 ℃；超声功率400 W。

4 结论

本研究先进行单因素实验，来探究乙醇浓度、液固比及超声温度、时间和功率对黄酮提取率的影响，结果表明超声功率的影响最小，综合考虑耗能因素选取400 W为最佳功率。而后，进一步通过正交试验分析另4种因素，得以确定酸枣果肉及果皮中黄酮的最优提取条件为：乙醇浓度55%；超声时间40 min；液固比 (mL/g) 27∶1；超声时间35 ℃；超声功率400 W。此时的酸枣果肉及果皮黄酮的浸取率为1.477%，相比于其他条件属最高且综合能耗较低，既满足使用要求，也符合经济效益；整体试验结果还表明酸枣果肉及果皮中有较多黄酮含量，具有很好的利用价值，本研究工艺很大程度上能促进酸枣资源的综合开发和产业开发。