太子参须提取物对小鼠免疫功能的影响

张炎达，潘慧青，衣伟萌，王 新，赵 齐，马玉芳*

（1.福建贝迪药业有限公司宁德市企业技术中心，福建 宁德 355300；2.中西兽医结合与动物保健福建省高等学校重点实验室，福建 福州 350002；3.浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江 杭州 310021）

太子参为石竹科植物孩儿参的干燥块根，主产于福建柘荣等地[1]。太子参富含多糖、皂苷、环肽等组分[2]，其药性平和，具有益气健脾、润肺、生津、保健之效。临床证明，太子参具有抗氧化、抗皮炎、增强免疫力及改善肺功能等作用[3-5]。研究表明，中药对动物机体免疫组织器官的发育有积极作用，有利于提高动物的免疫力[6]。补益中药太子参目前已在畜禽和水产中多有研究和应用[7-8]，且太子参须在动物养殖中的研究也相继报道，如太子参须可增强仔猪免疫[9]、抑制鸭H9N2亚型流感病毒在MDCK细胞上的体外增殖等[7]。太子参须为太子参的侧须和尾根，占太子参质量的10%～15%，且药效组分相同[10]。研究发现，太子参须提取物可改善免疫抑制小鼠的血清免疫指标及抗氧化指标[11]。陈小英等[12]报道，太子参须多糖粗提物对隐球菌感染模型小鼠的免疫功能具有调理作用。本文通过太子参须提取物低、中、高剂量灌服健康小鼠，探究其对健康小鼠免疫功能的影响，为太子参须中药资源在畜牧业中的开发与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 太子参须提取物

太子参须提取物（RPFRE）由福建贝迪药业有限公司宁德市企业技术中心提供。

1.1.2 试验动物

试验动物为购自福建医科大学实验动物中心的清洁级KM小鼠，雄性，体重（20±2）g。

1.1.3 试剂与仪器

刀豆蛋白（ConA）、胎牛血清、RPMI1640培养基、脂多糖（LPS）、Hank′s 平衡盐溶液（HBSS）、碳酸钠、四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、印度墨汁。

X-22R 台式高速冷冻离心机、SE202F 型电子天平、V-1200可见分光光度计等。

1.2 试验设计

清洁级雄性KM小鼠适应性饲养5 d后，称量体质量，随机分为4 组，空白对照组（CK）、RPFRE 低剂量组、RPFRE中剂量和RPFRE高剂量组，每组20只。CK组小鼠灌胃蒸馏水，试验组小鼠均灌服RPFRE，连续14 d。试验设计见表1。日常给予充足的水和食物，自由采食。各组小鼠于第15 d均随机分配，其中5只用于碳粒廓清法测定试验小鼠吞噬功能，5 只用于MTT 法测定试验小鼠脾T、B淋巴细胞增值。

表1 试验设计Tab.1 Experimental design

1.3 测定指标及方法

1.3.1 体质量

小鼠购回适应性饲养5 d 后，称体质量为初重。第15 d时再次称量小鼠体质量为末重，记录数值。

1.3.2 免疫器官指数

试验第15 d，称量小鼠的体重后，使用颈椎脱臼法处死小鼠，称量小鼠的脾脏、胸腺和肝脏，根据文献[13]计算方法计算正常小鼠的脾脏指数和胸腺指数。

1.3.3 吞噬功能

试验小鼠尾静脉注射印度墨汁（0.1 mL/10 g），分别于注射后第2、10 min 眼底静脉丛取血，加入碳酸钠溶液中，最好测定吸光度（OD值），根据文献[13]试验与计算吞噬指数α的方法计算获得α值。

1.3.4 小鼠脾脏T、B淋巴细胞刺激指数

试验组各取5只小鼠，用颈椎脱臼法处死，无菌取脾。详细试验方法和步骤参考文献[13]，制备的样本材料供脾细胞增殖备用。

采用96 孔细胞培养板，每孔加入100 μL 上述脾细胞悬液，空白孔和试验孔添加分别参照文献[13]，每只小鼠脾淋巴细胞设4复孔。置于5%CO2培养箱中培养44 h，每孔分别添加50μL MTT溶液，继续培养4 h，离心弃上清，每孔加入150 μL DMSO，低速振荡5 min，570 nm 波长测定各孔吸光度值。参考文献[13]计算T、B淋巴细胞刺激指数。

1.4 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 25 软件进行单因素方差分析（ANOVA），采用LSD 法进行多重比较分析，结果以“平均值±标准差”表示，P<0.05 表示差异显著。采用组间均联法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 RPFRE对小鼠体质量的影响（见表2）

由表2 可知，RPFRE 各剂量组较CK 均可提高小鼠体质量，且临床上未见不良作用。RPFRE低剂量组小鼠体质量较空白对照组显著提高（P<0.05）。

表2 RPFRE对小鼠体质量的影响Tab.2 Effect of RPFRE on the body weight of mice 单位：g

2.2 RPFRE对小鼠免疫器官指数的影响（见图1）

由图1（a）可知，RPFRE低剂量组小鼠脾脏指数显著高于空白对照组（P<0.05）；由图1（b）可知，RPFRE 高剂量组小鼠胸腺指数显著高于空白对照组（P<0.05）。研究表明，RPFRE能够促进小鼠免疫器官发育。

图1 RPFRE对小鼠免疫器官指数的影响Fig.1 Effect of RPFRE on the immune organ index of mice

2.3 RPFRE对小鼠巨噬细胞吞噬指数的影响（见图2）

由图2 可知，与空白对照组相比，RPFRE 高剂量组可显著提高小鼠吞噬指数α值（P<0.05）。

图2 RPFRE对小鼠巨噬细胞吞噬指数的影响Fig.2 Effect of RPFRE on the phagocytic index of mouse macrophages

2.4 RPFRE 对小鼠T、B 淋巴细胞刺激指数的影响（见图3）

由图3（a）可知，与空白对照组相比，RPFRE 中剂量组小鼠的T淋巴细胞刺激指数显著升高（P<0.05）；由图3（b）可知，RPFRE低、中、高剂量组小鼠B淋巴细胞刺激指数影响均不显著（P>0.05）。研究表明，RPFRE对小鼠的T、B淋巴细胞有一定的正向作用，其中对T淋巴细胞的影响更为显著。

图3 RPFRE对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响Fig.3 Effect of RPFRE on the proliferation of mouse T and B lymphocytes

2.5 RPFRE对小鼠免疫功能的聚类分析（见图4）

图4 RPFRE对小鼠免疫指标的聚类分析Fig.4 Cluster analysis of RPFRE on immune indexes of mice

药物临床试验评价中针对检测单一指标的结果进行评价药物作用具有一定的缺陷性和不准确性。在本研究中，通过对RPFRE不同剂量组影响小鼠5项生化指标进行数据标准化处理，实现与输出分析得到综合指标聚类分析结果，以期减少单一或某个指标评价结果的误差性，实现各监测指标分析结果的整体性和合理性。

由图4可知，当相近系数ε=5时，RPFRE不同剂量试验组对小鼠免疫功能5 项指标的综合聚类评价分为3 类，即Ⅰ：RPFRE（0.1 g/kg）、RPFRE（0.2 g/kg），Ⅱ：RPFRE（0.4 g/kg），Ⅲ：RPFRE（0 g/kg）；当相近系数ε=10时，具体结果同ε=5 时；当相近系数ε≥15 时，综合聚类评价分为2 类。Ⅰ：RPFRE（0.1 g/kg）、RPFRE（0.2 g/kg）、RPFRE（0.4 g/kg），Ⅱ：RPFRE（0 g/kg）。正常小鼠5项生化指标综合聚类分析表明，RPFRE能够改善正常小鼠免疫功能的生理生化指标，具有一定的免疫增强作用，其中RPFRE低、中剂量的作用较为明显。

3 讨论

太子参须为太子参的侧须和尾根，约占太子参质量的10%～15%，且药效组分与太子参相同[10]。本试验中，RPFRE 各剂量组较CK 均可提高小鼠体质量。RPFRE 低剂量组小鼠体质量显著提高，且临床上未见不良作用。前期Meta分析表明，太子参提取物在细胞水平上具有良好的安全性，RPFRE 在一定剂量范围内为安全的，这也符合补益中药的特点。同时，RPFRE灌服小鼠后对其脾脏和胸腺指数均有提高。脾脏和胸腺是动物机体主要的免疫器官，参与机体的细胞免疫和体液免疫，脾脏可分化大量T、B淋巴细胞参与免疫，是重要的外周免疫器官。因此，动物机体的免疫器官发育的状况直接影响其免疫力的高低[14]。另外，RPFRE 各剂量组均可提升小鼠T、B 细胞刺激指数。RPFRE 中剂量组小鼠T 淋巴细胞数量显著提高，表明RPFRE可通过促进正常小鼠免疫器官胸腺、脾脏的发育和免疫细胞免疫活性的增强，实现提升小鼠的机体免疫力。前期研究发现，RPFRE对正常小鼠血清抗氧化指标存在影响，RPFRE有提升总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）含量的效果[10]。因此，RPFRE 是否可以通过其抗氧化的药理作用发挥或影响其免疫调节作用需要相关性分析研究。

4 结论

太子参须提取物对小鼠体质量有提高作用，临床未见不良影响；可以改善小鼠免疫功能。综合聚类分析表明，低、中剂量的太子参须提取物作用较为明显。研究结果表明，太子参须提取物具有一定的免疫增强作用，具有开发免疫增强制剂新产品的潜力。