柱前在线衍生-高效液相色谱法同时测定复方丹参胶囊中19 种氨基酸

许有诚，赵庄，李丹凤

（广西壮族自治区食品药品检验所，南宁 530021）

复方丹参胶囊是由丹参、三七、冰片三味药材配制而成的中药复方制剂，具有活血化瘀、理气止痛等功效，常用于治疗冠心病、胸闷、心悸、心绞痛等疾病［1-2］。丹参和三七配伍使用，能使活血散瘀、通经止痛之功效倍增，且两者均含有氨基酸成分［3］。丹参为君药，是唇形科植物丹参的干燥根和根茎，具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神、抗肿瘤、抗菌、抗炎等功效［4］。丹参中氨基酸的成分主要有天门冬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸，总氨基酸的质量分数为9.6%［5］。三七为臣药，主要为五加科植物三七的干燥根，具有止血、补血、活血、抗炎消肿、保肝利胆等药理作用［6-7］。三七中氨基酸的成分主要有精氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸，不同产地三七的氨基酸含量不同［8-9］。

氨基酸是生命代谢的物质基础，是生物体内不可缺少的营养成分，对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用［10］。目前氨基酸的测定方法主要有高效液相色谱法［11-13］、毛细管电泳法［14-15］和液相色谱-串联质谱法［16］。大部分氨基酸在紫外检测区没有吸收，如果采用高效液相色谱法对其测定，需要对氨基酸进行衍生化处理，导致成本高、操作复杂，且分析时间长。毛细管电泳法可以采用间接紫外法，利用紫外吸收值较大的缓冲体系进行分析，根据吸收值的差异使氨基酸成分产生倒峰从而达到定量的目的，但是该方法重现性较差，且线性范围比较窄。液相色谱-串联质谱法采用离子对定量模式，可在多通道同时检测多个氨基酸，但是由于氨基酸的性质相近，在普通的液相色谱柱中很难得到有效分离，且异亮氨酸与亮氨酸等属于同分异构体成分，它们的母离子和子离子完全相同，质谱无法进行分离。笔者以邻苯二甲醛（OPA）和9-芴甲氧羰酰氯（FMOC）为衍生试剂，分别对一级氨基酸和二级氨基酸进行衍生化，不需要加热就能生成具有紫外吸收的衍生物，解决了氨基酸无紫外吸收而无法定量的问题，同时结合在线衍生技术，所有衍生步骤均由仪器自动完成，避免了人工衍生化过程带来的操作误差，在此基础上建立了同时测定复方丹参胶囊中19 种氨基酸含量的高效液相色谱法，该方法操作简单，具有良好的重复性和稳定性，为复方丹参胶囊质量标准的研究和应用提供了参考依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

电子分析天平：XD205DU 型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

高效液相色谱仪：Agilent 1260 型，配有DAD检测器、ChemStation 工作站，美国安捷伦科技公司。

超声波清洗器：CQX25-06 型，频率为45 kHz，上海超声波仪器厂。

溶出度及自动取样系统：EDT-14Lx 型，印度Electrolab 公司。

衍生试剂：邻苯二甲醛（OPA），批号为5061-3335，质 量 浓 度 为10 mg／mL；9- 芴 甲 氧 羰 酰氯（FMOC），批 号 为5061-3337，质 量 浓 度 为10 mg／mL，美国安捷伦科技公司。

硼酸盐缓冲液：pH 值为8.2，批号为5061-3339，质量浓度为12.37 g／L，美国安捷伦科技公司。

甲醇、乙腈：均为色谱纯，德国默克公司。

磷酸氢二钠、硼酸钠：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

复方丹参胶囊样品：共10 批，编号分别为1＃～10＃，市售。

19 种氨基酸对照品：基本信息见表1。

表1 19 种氨基酸对照品基本信息

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent HPH-C18柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm，美国安捷伦科技公司）；流动相：A 为10 mmol／L 硼酸钠-磷酸氢二钠缓冲液混合溶液（用6 mol／L 盐酸调节pH 值至8.2），B 为乙腈-甲醇-水（体积比为41∶41∶18）溶液；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：0～2 min，B 的体积分数为5%；2～25 min，B 的体积分数由5%逐渐增加至43%；25～26 min，B 的体积分数由43%逐渐增加至100%，保持3 min；29～30 min，B 的体积分数由100%逐渐降至5%，保持5 min；流量：1.0 mL／min；柱温：40 ℃；检测波长：338 nm（当赖氨酸出峰后将波长切换成262 nm）；进样体积：1 μL。

1.3 在线衍生程序

自动进样器吸取1.0 μL 样品溶液和2.5 μL硼酸盐缓冲液，于清洁口混合6 次；等待0.5 min，精密加入0.4 μL OPA 衍生试剂混合10 次，然后再加入0.2 μL FMOC 衍生试剂混合10 次，最后精密加入32 μL 稀释液（由200 mL 流动相A 和0.8 mL浓H3PO4混合而成）混合10 次后进样测定。

1.4 溶液配制

19 种氨基酸混合对照品溶液：分别精密称取19 种氨基酸对照品各约10 mg，置于同一100 mL容量瓶中，加入0.1 mol／L 盐酸溶液溶解并稀释至标线，混匀，配制成19 种氨基酸的质量浓度均约为100 μg／mL 的混合对照品溶液。

19 种氨基酸系列混合标准工作溶液：分别精密吸取19 种氨基酸混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，分别置于7 只10 mL 容量瓶中，用0.1 mol／L 盐酸溶液定容至标线，混匀，配制成系列混合标准工作溶液。系列混合标准工作溶液中19种氨基酸的质量浓度见表2。

表2 系列混合标准工作溶液中19 种氨基酸的质量浓度μg／mL

供试品溶液：取复方丹参胶囊20 粒，将内容物倾出，混匀，研磨成细粉，精密称取细粉1.0 g，置于25 mL 容量瓶中，加入0.1 mol／L 盐酸溶液适量，超声20 min 使其溶解，冷却至室温后用0.1 mol／L盐酸溶液定容至标线，以8 000 r／min 转速离心15 min，取上清液滤过，取续滤液即得供试品溶液。

阴性空白溶液：按处方比例制备不含丹参及三七药材的空白辅料，精密称取1.0 g，置于具塞锥形瓶中，按供试品溶液制备方法制备阴性空白溶液。

2 结果与讨论

2.1 流动相pH 值选择

选用同一份混合对照品溶液，考察流动相A 的pH 值分别为8.6、8.4、8.2、8.0 时19 种氨基酸的分离情况。结果发现，在相同流动相比例下，随着流动相A 的pH 值增大，谷氨酰胺、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸的分离效果越差，当流动相A 的pH 值为8.2 时，19 种氨基酸的分离效果最好，因此选择流动相A 的pH 值为8.2。

2.2 检测波长选择

19 种待测氨基酸中，有16 种为一级氨基酸，即前16 个色谱峰，可以与衍生剂OPA 反应，在338 nm 波长处有最大吸收峰。羟脯氨酸、肌氨酸、脯氨酸（后3 个色谱峰）为二级氨基酸，可以与衍生剂FMOC 反应，在262 nm 波长处有最大吸收峰。安捷伦1260 型液相色谱仪可以选择多个通道同时测定待测物，也可选择在某个时间段进行波长切换测定。OPA-赖氨酸衍生物和FMOC-羟脯氨酸衍生物两个色谱峰间隔为0.6 min，因此可以选择在这一时间段进行波长切换，从而能够在同一色谱图中同时检测OPA 衍生化氨基酸和FMOC 衍生化氨基酸。

2.3 衍生剂用量选择

OPA 衍生剂主要与一级氨基酸进行反应，FMOC 衍生剂主要与二级氨基酸进行反应。如果在线衍生过程加入衍生剂OPA 与FMOC 的量过少，会导致19 种氨基酸不能得到充分衍生，影响定量结果。如果加入量过多，则进样口有多余的衍生剂，导致仪器堵塞甚至被损坏，因此需要对衍生剂OPA 与FMOC 的体积进行考察。

以16 种一级氨基酸作为测定对象，考察衍生剂OPA 的用量分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL 时16 种氨基酸的衍生效果。结果发现，当OPA 的用量为0.1～0.4 μL 时，16 种氨基酸的色谱峰面积随着OPA 用量的增加而增大；当OPA 的用量为0.4～0.6 μL 时，16 种氨基酸的色谱峰面积变化不明显，说明OPA 的用量为0.4 μL 时16 种一级氨基酸已得到充分衍生，因此选择OPA 的用量为0.4 μL。

以3 种二级氨基酸作为测定对象，分别考察衍生剂FMOC 的用量为0.1～0.4 μL 时3 种氨基酸的衍生效果。结果发现，当FMOC 用量为0.1～0.2 μL 时，3 种氨基酸的色谱峰面积随着FMOC 用量的增加而增大；当FMOC 的用量为0.2～0.4 μL 时，3 种氨基酸的色谱峰面积变化不明显，说明FMOC的用量为0.2 μL 时3 种二级氨基酸已得到充分衍生，因此选择FMOC 的用量为0.2 μL。

2.4 专属性考察

分别取适量1.4 中的阴性空白溶液、对照品溶液、供试品溶液，在1.2 色谱条件下分别进样测定，结果如图1 所示。由图1 可以看出，阴性空白溶液不干扰测定结果，混合对照品溶液中19 种氨基酸的分离度均大于2.0，供试品溶液中各色谱峰的分离度均大于1.5，说明该方法专属性良好。

图1 阴性空白溶液、对照品溶液、供试品溶液色谱图

2.5 稳定性试验

取1.4 中的混合对照品溶液，室温放置，分别于配制后第0、1、2、4、8、16、24 h 时进行在线衍生，在1.2 色谱条件下测定19 种氨基酸的色谱峰面积，结果见表3。由表3 可知，19 种氨基酸色谱峰面积测定结果的相对标准偏差为0.5%～1.5%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

表3 稳定性试验结果

2.6 线性方程与检出限

取1.4 中的19 种氨基酸系列混合标准工作溶液，按1.2 色谱条件进样测定。以待测氨基酸的质量浓度（x）为横坐标，以对应的色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制工作曲线，计算线性方程和相关系数。在1.2 色谱条件下对1＃溶液进样测定，以3 倍信噪比对应的氨基酸质量浓度为方法检出限。

19 种氨基酸的线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表4。

表4 19 种氨基酸的线性范围、线性方程、相关系数及检出限

2.7 重复性试验

取复方丹参胶囊20 粒，将内容物倾出，混匀，研磨成细粉，按1.4 方法平行制备6 份供试品溶液，在1.2 色谱条件下进行测定，记录色谱峰面积，计算样品中各氨基酸的质量分数，结果见表5。由表5可知，测定结果的相对标准偏差为0.1%～1.8%，表明该方法重复性良好。

表5 重复性试验结果

2.8 加标回收试验

精密称取0.5 g 已知氨基酸含量的复方丹参胶囊细粉，置于25 mL 容量瓶中，平行制备6 份，分别加入1.4 中的混合对照品溶液1.0 mL，按1.4方法制备加标供试品溶液，在1.2 色谱条件下测定各氨基酸的色谱峰面积，并计算回收率，结果见表6。由表6 可知，19 种氨基酸的加标平均回收率为91.4%～106.5%，表明该方法具有较高的准确度。

表6 加标回收试验结果（n=6）

2.9 样品测定

取10 批复方丹参胶囊样品，按1.4 方法制备供试品溶液，在1.2 色谱条件下进行在线衍生测定，记录色谱峰面积，计算样品中各氨基酸的含量（质量分数），结果见表7。由表7 可知，不同生产厂家的复方丹参胶囊中氨基酸含量丰富，共检测出异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸6 种人体必需的氨基酸。样品中含量较高的氨基酸为门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、脯氨酸。不同厂家的样品中氨基酸总量差异较大，因为每个厂家所用的丹参及三七的药材来源各不同。

表7 样品测定结果

3 结语

样品用0.1 mol／L 盐酸溶液溶解，经超声提取后以OPA-FMOC 作为衍生试剂进行在线衍生，建立了柱前在线衍生-高效液相色谱法同时测定复方丹参胶囊中19 种氨基酸含量的方法。该方法操作简单，结果准确可靠，重复性良好，避免了传统的人工衍生化过程带来的操作误差，并首次从氨基酸的角度评价复方丹参胶囊的质量，为复方丹参胶囊质量控制提供技术支持。