响应面法优化余甘子种质资源ISSR反应体系

王建超 何银莺 黄旭萍 沈朝贵 陈发兴 郭林榕

摘要：【目的】優化余甘子种质资源ISSR-PCR反应体系，为余甘子种质资源遗传多样性及亲缘关系研究提供基础。【方法】以缅甸、印度、广东、云南、福建等5份来源小同的余甘子种质资源的基因组DNA组成混合的DNA模板，综合单因素试验和响应面分析法，分析引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、DNA模板量、退火温度等反应条件对IS SR-PCR反应体系的影响，优化建立余甘子IS SR-PCR反应体系。【结果】引物浓度和2×Taq MasterMix添加量对扩增效果有较大影响，DNA模板量影响较小;引物浓度和DNA模板量交互作用明显;余甘子ISSR反应体系为引物浓度0.4 umol L-l，2×Taq Master Mix添加量l3 uL， DNA模板量30 ng，扩增结果与响应面分析模型理论值相对误差仪为9.39%;退火温度为50.5- 52.7℃时，随着温度的升高，条带质量变好，数量变多，退火温度为52.7℃时可获得多样性好的清晰条带。【结论】获得ISSR-PCR反应体系为引物浓度0.4 umoI·L-1，2×Taq MasterMix添加量13 UL， DNA模板量30 ng，退火温度52.7℃，扩增循环数35循环，扩增获得的条带清晰、稳定，多样性好，该体系适于余甘子种质资源的遗传多样性和亲缘关系等分析研究

关键词：余甘子;ISSR-PCR;响应面;体系优化

中图分类号：S 682.310.36

文献标志码：A

文章编号：1008-0384（ 2021） 07-075907

Response Surface Optimization of ISSR-PCR Reaction for Genetic Study on

Phyllanthus Emblica

WANG Jianchao1.2. HE Yinying2. HUANG Xuping2， SHEN Chaoguj1， CHEN Faxing2. Guo Linrong1*

（l.Fruit Research Institute， Fujian Academy ofAgricultural Sciences. Fuzhou， Fujian 350013，China：

2.College ofHorticulture， Fujian Agriculture and Forestrv University. Fuzhou， Fujian 350002. China）

Abstract： 【Objective】 ISSR-PCR reaction system for genetic study on Phyllanthus emblica germplasms was optimized【Methods】 A mixed DNA template composed of genomic DNA ofP emblica germplasms came from Myanmar. India.Guangdong， Yunnan， and Fujian was obtained. The single factor test and response surface analysis were used to optimize theISSR-PCR reaction conditions including primer concentration. amount of 2×Taq Master Mix. DNA template amount， andannealing temperature.【Result】 The primer concentration and addition amount of 2×Taq Master Mix had a greater impacton the amplification than did the DNA template amount. A significant interaction between the primer concentration and DNAtemplate amount was found. The optimized system with a primer concentration of 0.4 ymoI·L-1.a 2×Taq Master Mix of13 UL， and a DNA template concentration of 30 ng was established that achieved a low relative error of 9.39% in predicting thetheoretical response. Within the annealing temperature between 50.5 ℃ and 52.7 ℃. increasing temperature improved thenumber and quality of bands. When the annealing temperature is 50.5-52.7.C，the number of strips increases. and the quality ofthe strips becomes better with the increase of temperature. The annealing temperature is 52.7℃to obtain good diversity andclear bands. 【Conclusion】 The optimized ISSR-PCR reaction system was established applying a primer concentration of0.4 umoI-L-1，a 2×Taq Master Mix ofl3L，aDNA template concentration of 30 ng at the annealing temperature of 52.7℃for35 amplification cycles. The methodology could be used to study the genetic diversity and relationship of P. emblicagermplasms .

1.3统计分析

采用Excel 2016、Design Expert 8.0.6等软件进行统计分析，其中Design Expert 8.0.6进行响应面试验设计、数据分析和模型的建立。

2结果与分析

2.1单因素对ISSR反应体系的影响

单因素试验的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳结果如图2，可见，引物浓度与2×Taq Master Mix添加量对反应体系的影响较大。引物浓度偏高或偏低都会影响扩增结果，引物浓度过高会引起引物与DNA模板错配和非特异性产物扩增，增加产生二聚体的概率，引物浓度偏低则不易测出扩增位点，本研究引物浓度为0.30～0.40 umol.L-l时电泳效果较好。2×Taq Master Mix含有Taq DNA聚合酶、dNTP混合物和Mg2+等反应原料，Taq DNA聚合酶直接影响扩增反应的成功与否，浓度过高容易产生非特异的PCR产物，dNTP是ISSR分子标记扩增的重要原料，浓度过高易错配，过低影响合成效率，2×Taq MasterMix添加量为12～14 uL为最佳。DNA模板量范围取决于物种基因组大小和DNA纯度，研究表明，DNA模板量对余甘子ISSR-PCR的影响较小，考虑电泳条带质量和数量，选择DNA模板量最佳为30 ng。

2.2响应面法优化ISSR反应体系

以电泳图谱（图3）中电泳条带数量、清晰度、重复性、亮度和背景干净程度的评分（5名科研T作者主观评分）为响应值（表4），采用多元回归拟合，获得引物浓度（X1），2×Taq Master Mix添加量（X2），DNA模板量（X3）的二次多项回归模型为F=11.92-0.437 5X1-O.5 5X2 -1.737 5X2-0.75XIX21.575XIX3-0.55X2X3-4.2975Xl2-3.5225X2--2.1975X32。检验方程的有效性，对数学模型进行方差分析电泳图评分为响应值时，该二次方程模型有统计学意义（p-0.012 6<0.05），说明该模型对本试验有较好拟合;回归方程失拟性检验无统计学意义（p-0.7571），表明未知因素对试验结果干扰很小，模型能较好地反应真实的试验值，可用于响应值的分析和预测，所得的回归方程模型能较好地预测电泳图谱得分随各参数的变化规律。试验所选三因子X1、X2和X3中X3达到显著影响（p<0.05），Xl、X2因子二次项均达到极显著影响（p<0.001）表明单因素X2对响应结果影响较大，且X1与X2因子有极显著的交互影响。

根据回归拟合方程得出各试验因子引物浓度（X）、2×Taq Master Mix添加量（X2）、DNA模板量（X3）两两因素交互作用的等高线图（图4），等高线图可直观反映出2个变量间交互作用的显著程度，其中圆形表示两两因素交互作用不显著，而椭圆形表示两两因素交互作用显著[16];等高线图由蓝到红的变化越快，沿白变量方向高度差越大[17]，引物浓度（Xl）和DNA模板量（X3）之间交互作用显著。

根据Design Expert 8.0.6软件分析出的若干解决方案与其相应预测得分值，考虑到保证高响应值的同时节约成本，对响应面优化结果进行最优分析验证，得到ISSR反应体系的实际值（图5），该值与理论预测值进行比较计算相对误差，结果见表5。结果表明，最优实际解决方案引物浓度为0.40 umol·L-1，2×Taq Master Mix添加量为13.0 uL，DNA模板量30 ng，该条件与理论预测响应值13.130 4的相对误差仅为9.39%，说明该模型具有好的分析能力，可为实际操作提供良好的指导。

2.3退火温度对ISSR反应体系的影响

退火温度影响ISSR图谱的稳定性，较低的退火温度可保证引物与模板结合的稳定性，但较易产生错误的扩增。由电泳图谱（图6）可知，35循环数下，50.5～54.0℃隨着退火温度的升高谱带质量与条带数有较明显的变化，退火温度为50.5—52.7℃时，随着温度的升高条带数呈增加趋势，条带质量变好，52.7～54.0℃时，部分条带模糊，缺失。选择较高的退火温度可减少引物和模板间非特异性的结合，提高扩增产物的特异性，综合谱带质量和条带数，退火温度为52.7℃时最佳，可获得较好的扩增效果。

通过优化得到ISSR-PCR反应的体系为引物浓度为0.4 umol·1-1，2×Taq Master Mix添加量为13 uL，DNA模板量30 ng，退火温度为52.7 0C，循环次数35次;将该体系应用于不同余甘子种质资源效果见图7，引物UBC841在该体系下可扩增出条带清晰和多态性良好的电泳图谱，表明该体系适宜应用于余甘子种质资源的遗传多样性和亲缘关系研究。

3讨论与结论

ISSR是在SSR的基础上发展起来的一种新型的分子标记，目前，ISSR已广泛用于植物品种鉴定、遗传图谱、遗传多样性及分子生态学研究[18.19]。ISSR分子标记技术基于PCR反应，其扩增谱带受反应条件和扩增程序变化以及物种不同的影响，采用不同的反应体系组合和扩增程序电泳结果差异较大，因此，开发ISSR分子标记对其反应体系和扩增程序优化显得必不可少。

本研究综合运用单因素试验与响应面分析法，首先确定了各因素的有效范围，再对各因素组合优化，从而确立普遍适用于余甘子种质资源的ISSR-PCR反应体系。本研究PCR扩增采用2×Taq MasterMix试剂，该试剂将多种扩增原料混合，研究结果虽未能直观体现Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+等原料对余甘子ISSR-PCR反应体系的影响[20]，但可大大提高T作效率，达到了节省物料、简便、快速的目的，可在ISSR分子标记研究中加以推广应用。本研究结果表明引物浓度对余甘子ISSR反应体系影响较大，DNA模板量与引物浓度有显著的交互作用，与前人研究较一致[21.22]。应用响应面法对影响ISSR反应体系的主要因素进行筛选，建立余甘子ISSR反应体系模型F=11.92-0.437 5X1-0.55X2 1.737 5X30.75XIX2 1.575X1X3 0.55X2X3 4.297 5Xl2 3.522 5X222.197 5X22，可较快地得到最优组合，避免了单因素试验结果的不足。

本研究确立余甘子ISSR-PCR反应体系：引物浓度为0.4 UMol·1，2×Taq Master Mix添加量为13 UL，DNA模板浓度30 ng，扩增循环数为35循环，退火温度52.7℃;扩增获得的条带清晰、稳定，多样性好，可应用于余甘子种质资源的遗传多样性分析和亲缘关系研究。

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（责任编辑：黄爱萍）

收稿日期：2021-03-16初稿：2021-05-12修改稿

作者简介：王建超（1988-），男，研究实习员，研究方向：热带与业热带果树种质资源保护与生理生化研究（Email： 447327289@qq.com）

通信作者：郭林榕（ 1963-），女，副研究员，研究方向：热带与业热带果树种质资源保存、选育种及栽培研究（Email： linrong-g@163com）

基金项目：福建省科技计划公益类专项（ 2019Rl028—ll）：国家热带植物种质资源库（余甘子种质资源分库）（NTPGRC2021-011）：农业农村部物种品种（热带作物）资源保护项日（ 151821301354052701）