双光子显微镜技术在脑微循环研究中的应用

刘双双 王 君 尹 伟 娄绘芳 沈 逸*

1(浙江大学医学院，杭州 310058)2(浙江大学校医院，杭州 310058)

引言

脑微循环观测对于预防脑中风、控制高血压、探讨阿尔兹海默症及脑缺血疾病的发病机制具有重要意义。长期以来，利用传统光学显微镜构建的微循环显微观测系统，在研究活体动物微循环网络及血流灌注中发挥了很大作用。但因场光源照明以及局部宽视野平面成像，使得成像对比度和光学分辨率受到极大限制。激光共聚焦显微镜使用激光光源，并采用共聚焦成像技术，显著提高了显微成像的分辨率。但针孔在克服了焦平面外散射光影响的同时，也阻挡了来自焦平面发生散射的信号光子，影响了探测深度，因此更适合研究较薄的组织样本(≤80 μm)。双光子显微镜突破了上述瓶颈，使得深层组织探测以及活体组织长时观测成为可能。

双光子显微镜以红外脉冲激光作为光源，深入组织内部非线性激发荧光，具有较强的穿透力以及较低的光毒性，可以实时、连续地对活体内部的结构和功能进行长时程检测，已成为活体成像研究中的重要工具，其应用领域涵盖了从离体到活体、从分子到网络、从结构到功能等多个层次，研究对象涉及脑、皮肤、眼睛、心脏、肠、肺等多种器官。

近年来，双光子显微镜研究在脑微循环中的应用发展迅速，其特殊优势被充分发挥。双光子显微镜可以实时跟踪脑深部单根微血管血流信号的变化，对这些信号进行光学操控，已成为脑内微循环结构与功能研究的强有力工具[1]。下面论述双光子显微镜技术的基本原理和特点，介绍其最新的相关进展，对其在脑微循环研究中的应用现状及发展趋势进行讨论和展望。

1 双光子显微镜技术

1.1 双光子显微镜的技术原理

激光共聚焦显微镜发生激发时，荧光分子吸收一个光子(λ1)，电子跃迁到激发态，当电子回到基态时，发射出一个新光子(λ2)，又称为单光子激发。双光子显微镜又称多光子显微镜，其激发原理是在高光子密度条件下，荧光分子接近同时吸收两个长波长的光子(λA和λB)，在经过一个很短的激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的新光子(见图1(a))。根据Göppert-Mayer理论，单光子和双光子的激发波长满足

图1 单光子和双光子荧光激发原理。(a)单光子和双光子激发原理(其中S0为基态，S1为激发态)；(b)单光子和双光子激发体积的比较Fig.1 Schematic diagram of excitation principle of single-photon and two-photon fluorescence. (a) The excitation principles of single-photon and two-photon fluorescence. S0 is the ground state and S1 is the excited state; (b) Comparison of the excitation volumes in single-photon (left) and two-photon excitation (right) fluorescence

1/λ1≈(1/λA+1/λB)-1

(1)

λA和λB波长可以不同，但必须接近同时到达荧光基团，两个光子到达荧光基团的时间差为飞秒级(10-16s)[2]。通常，这种几乎同时的吸收概率非常低，因为双光子吸收效率与荧光分子的吸收截面成正相关，吸收截面一般较小，为10-48～10-50cm4s，所以只有光子密度足够高的地方才能发生双光子吸收[3-4]。

单光子激发时，激发光照射到样本上，形成沙漏状的照射范围，整个照射区域内的荧光分子都被激发而产生荧光，检测器通过探测针孔阻挡非焦点处的荧光信号。双光子激发只发生在焦点处，不需要探测针孔(见图1(b))，因此双光子显微镜具有穿透能力强、激发区域小、光毒性小的特点[5](见表1)。

表1 共聚焦显微镜和双光子显微镜特点比较

1.2 双光子显微镜技术的最新进展

近年来，双光子显微镜技术向着“广、深、快”方向快速发展，即视场范围更广、探测深度更深、扫描速度更快。微型化双光子显微镜的出现，使自由活动小鼠脑功能成像成为可能。

在视场范围方面：传统的双光子成像系统视场仅限于0.5 mm，限制了不同脑区神经元活动的同时检测。目前，已开发了多种大视场双光子显微镜技术，视场范围达到5 mm以上。这些技术可分为两类：一是单光束扫描技术，使用定制的大视场物镜、声光偏转器(acousto-optic deflector, AOD)等硬件设备，高速穿越大范围神经组织，如 2P-RAM[6]、TPLSM[7]；二是多光束扫描技术，运用不同激光束扫描脑内的不同区域，同时检测神经组织的不同位置，如Trepan2P[8]、SLM[9]、DIESEL[10]。

在扫描速度方面：随着快速钙指示剂的引入[11]和电压指示剂的最新改进[12]，高速成像已成为双光子显微镜发展的主要方向。提高成像速度的方法与增大视场的策略类似，依赖单光束(acousto-optic deflector，AOD)扫描技术实现毫秒级的钙成像，或利用Beseel光束增加3D扫描速率[13]。最新发展的SLAP技术是利用多个角度的序列线扫描技术采样整个视场，实现了kHz 的采样速率[14]。

在扫描深度方面：增加扫描深度最有前景的方式是使用波长更长的激发光。目前的研究热点集中在激发波长更长的三光子成像技术，三光子成像的最佳激发波长为1 600～1 800 nm，此波段的激光能够避开组织中水对红外光的吸收峰，更好地穿透组织，更大程度地提升了成像深度[15-16]。

自由活动小鼠脑成像技术一直是科学家追求的目标。程和平课题组研制了新一代高速高分辨微型化双光子显微镜[17]。此设备仅重2.2 g，采用双轴对称高速微机电系统转镜扫描技术，具有多区域随机扫描和1万条/s的线扫描能力；采用可传导920 nm激光的光子晶体光纤，以及MEMS反射镜和柔性光纤束，解决了荧光传输时光缆受到动物拖拽的难题。

2 双光子显微镜的实际应用

2.1 量化血流动力学变化

微循环精细化研究需要检测单根微血管内血细胞动力学变化，双光子显微镜具有探测能力强、光毒性小的优势，使得观察活体小鼠脑内单根微血管成为可能。通过脑颅骨开窗手术，制备活体动物脑微循环成像样本[20-21]，将葡聚糖偶联的大分子量荧光染料经尾静脉注入，经过血液循环到达全身(见表2)[22]。荧光染料特异性标记血浆而不进入红细胞，红细胞在有荧光背景的血浆中呈现黑色，通过追踪红色细胞的运动轨迹，实现运动速度、方向以及血流量等微血流动力学参数的测量。

表2 标记血液的荧光染料Tab.2 Blood fluorescent labeling dye

血流量为单位时间内流经微血管截面的红细胞数目，与血液携带氧气和营养的能力成正比，是常用来检测血流与神经活动耦合的参数之一。量化血流量需要测量血流速度和血管直径，因血流速度和血管直径各自独立发生改变，所以需要同时测量这两个参数。双光子活体成像时，血管内无法同时画出两条直线进行线扫描。2009年，Kleinfeld提出用户自定义的扫描路径，其定义为一条包含直线和曲线的线段，其中穿越血管中心线的部分用来测量血流速度，横跨血管宽度的线段部分用来测量血管直径，两部分之间用曲线连接(见图2)。Kleinfeld利用此方法发现：在微动脉中，刺激导致的血流量增加是由血管直径和血流速度两方面的增加引起的，而微静脉血流量的增加仅与血流速度的增加有关，血管直径保持不变。

图2 空间优化的线扫描同时测量血管直径和血流速度[23] (A：荧光标记脑皮层血管；B：线扫描时扫描线段由横穿血管(径向)、平行血管(轴向)和连接线组成；C：彩色图表示需要的路径和实际扫描路径的误差；D：线扫描图像；E：血管直径和血流速度的计算方法；F：微动脉和微静脉中血管直径、血流速度与血流量的关系)Fig.2 The diameter and blood flow velocity of vessels are measured simultaneously by spatially optimized line scanning mode[23] (A: Fluorescent labeling cortical blood vessels; B: During line scanning, the scanning line segment consists of crossing blood vessels, parallel blood vessels and connecting lines; C: The error between the required path and the actual scanning path is expressed by color diagram; D: Line scanning images; E: The calculation method of blood vessel diameter and flow velocity; F: The relationship between vessel diameter, blood flow velocity and blood flow volume)

利用双光子显微镜技术研究血流动力学的成果不断涌现，主要包括以下方面：

1)触觉皮层和嗅球等感觉区域的血流动力学变化。1998年，Kleinfeld首次使用双光子显微镜，发现刺激胡须后大鼠新皮层血流发生波动，但却没有检测到血流变化的幅度[18]。Tiret 等发现，气味引起嗅球部位的血流速度变化，并具有浓度依赖性[27]。

2)疾病模型血流动力学变化。在癫痫动物模型中，Bicucullin诱导病灶区毛细血管的血流速度增加[28]。在糖尿病小鼠中，皮层毛细血管的血流速度明显变慢，并在缺血后产生湍流[29]。Schrandt等对中风模型进行了长期观察，发现形成血栓时，受损区域的血流量降到正常值的25 %左右，发病后14 d，血流量大幅回升，发病后28 d，病灶区的脉管系统恢复再灌注[30]。

3)研究神经-血管耦合。正常脑功能依赖于神经血管耦合[31]，神经活动引起局部血流量迅速增加，以满足局部脑能量需求的瞬时变化。传统观点认为，神经元或星形胶质细胞释放血管舒张因子，直接作用于平滑肌细胞，引起动脉扩张，增加局部血流量[32]。研究发现，血管舒张主要由内皮细胞上的小窝介导，通过小窝依赖性通路，积极地从中枢神经系统向平滑肌细胞传递信号，促进平滑肌松弛[33]。

2.2 测量血氧分压

氧气是一切有氧生物保持活性的基础，监控脑中氧的代谢及运输过程，对理解正常或者疾病状态下脑内氧气传递和消耗具有重要意义。在多种光学测量方法中，双光子显微镜结合磷光粹灭法具有优越的系统稳定性、良好的重复性以及较低的耗氧性，是一种非常切合实际并且成熟的技术手段。该方法的原理是磷光探针受激后，会以发射磷光的形式返回至基态，氧的存在会干扰这一过程的进行，使得磷光寿命受其影响[34-35]。磷光寿命与氧压的关系如下：

(2)

式中，kq为光敏剂分子淬灭常数(Stern-Volmer常数)，T为有氧环境下的荧光淬灭时间，T0为无氧环境下的磷光淬灭时间。磷光粹灭法能够精确地检测氧压值，分辨率达到微米级[36-37]。

由于一般的磷光探针(如prophyrin)双光子吸收横切面低，需要较高激发能量或探针浓度才能激发，所以使双光子显微镜的应用受到限制。2010年，Sava sakadzic介绍了一种有效的双光子测量氧分压(PO2)方法，通过运用优化的双光子成像系统和改进的磷光纳米探针PtP-C34325，成功实现了脑深处毛细血管PO2测量(见图3)。其中显示了颅骨开窗后脑内PO2的测量方法，在脑内分别测量动脉和静脉PO2，从曲线可看出动脉的氧含量更高[38]。

图3 血管内氧压成像[38](A：脑血管最大荧光强度投射；B：脑内166 μm处微血管磷光强度；C：动脉和穿支静脉磷光衰减曲线，蓝色和红色分别是B图箭头指向的两个血管；D：脉管系统氧压测量；E：氧压与皮层深度的关系)Fig.3 Intravascular oxygen pressure imaging[38] (A: Maximum fluorescence intensity projection of blood vessels in the brain; B: Microvascular phosphorescence intensity diagram at 166 μm under cortex; C: Phosphorescence attenuation curves of perforator artery and perforator vein; D: Measurement of oxygen pressure in vascular system; E: Relationship between oxygen pressure in blood vessels and cortical depth in three mice)

自PtP-C34325磷光探针出现后，测量氧分压技术在健康和疾病动物模型中都得到了广泛应用。2013年，Kazmi等证实了靶向光凝血栓前后小鼠皮层小动脉中的氧分压(PO2)情况[39]。2017年，Xu等在小鼠大脑皮层200 μm处，检测了正常氧和轻度低氧条件下的脑组织氧分压[40]。2018年，Sullender等在小鼠脑内诱导定点脑血栓后，同时测量了PO2和血流速度[41]。上述研究仅停留在动物麻醉状态，生理状态下的氧浓度仍然难以确定。2016年，Lyons在清醒小鼠血管和间质中测量了脑内PO2，清醒动物脑内PO2约为异氟烷麻醉下的一半，在皮层的不同部位PO2不同，这与麻醉状态下记录的结果明显不同[42]。双光子显微镜与氧探针结合技术已经在组织水平成功实现，下一步的挑战是高分辨率下精确测量细胞水平的氧分压。

2.3 检测白细胞-内皮细胞的相互作用

在神经系统疾病的病理机制中，中枢免疫反应起着重要作用。中枢发生炎症时，致炎因子或来源于病原体的刺激，使脑血管的内皮细胞表面吸引白细胞。白细胞通过选择素介导的松散键，沿着内皮细胞滚动，随后被管腔表面的趋化因子激活，导致白细胞整合素的激活，以及在内皮上的牢固停滞。最后，白细胞利用跨细胞途径或者旁细胞途径，穿过内皮屏障。所以，炎症过程的一个重要特征是白细胞与内皮细胞的相互作用。小鼠尾静脉注射Rhodamine-6G标记白细胞，利用双光子显微镜，对滚动的、松散黏附的和紧密黏附的白细胞进行定量，能间接反映周围组织的炎症情况[43-44]。

双光子显微镜已用于研究多种脑疾病动物的白细胞黏附与迁移机制。在阿尔茨海默病(AD)的小鼠模型中，发现血管内的中性粒细胞渗透到大脑实质，并向淀粉样斑块迁移[45-46]。最近的研究发现，在AD小鼠模型中，发生阻塞的毛细血管数目增加，原因是中性粒细胞黏附在毛细血管，阻断了血液流动；使用抗中性粒细胞特异性蛋白Ly6G 的抗体后，阻塞的毛细血管数量明显减少，使血流量增加，并提高了短期记忆能力[47-48]，提示干预中性粒细胞黏附可能是治疗阿尔茨海默病的新途径。在脓毒症小鼠模型中，脑血管白细胞运动缓慢，发生黏附现象；随着造模时间的增加，白细胞与内皮细胞的相互作用越来越明显(见图4)[49]。在中风小鼠模型中，发现中性粒细胞黏附在远端毛细血管段上，导致梗塞核心区和半影区20%～30%的微血管阻塞。使用抗Ly6G抗体耗竭中性粒细胞后，可恢复微血管灌注[50]。Liu等研究了中成药通心络在脑卒中治疗方面的作用及机制，发现药物通过抑制内皮细胞与红细胞的相互作用来减轻脑缺血损伤[51]。另外，在糖尿病、神经炎症等疾病模型[52-53]中，也检测了白细胞-内皮细胞的相互作用，以及药物处理后的影响[54]。

图4 中性粒细胞在血管内运动情况[49](A：Sham组(假手术动物)白细胞黏附较少，CLP组(脓毒症动物)白细胞随时间增加黏附越来越多；B：Sham与CLP组白细胞黏附数目；C：Sham与CLP组白细胞滚动的速度)Fig.4 The movement of leukocytes in blood vessels of sham and CLP animals[49] (A: Sham is a sham-operated animal with less adhesion of leukocytes in blood vessels, and CLP is a septic animal, the adhesion of leukocytes was measured 4,8 and 10 h after modeling, and the adhesion increased gradually; B: Adhesion number of leukocytes per unit area in B Sham group and CLP group; C: Rolling speed of leucocytes in Sham group and CLP group)

2.4 建立脑中风动物模型

构建脑中风动物模型是开展脑缺血损伤研究的基础，可为临床脑缺血治疗提供更合理实用的研究模型。光化学技术已经广泛应用，通过小鼠尾静脉注射光敏感物质(如rose bengal)，绿色激光照射光敏感物质后产生单态氧，单态氧损伤血管壁的内皮细胞，导致血栓形成，但上述方法更适合对大脑表面大动脉和靠近表面的穿透动脉产生血栓[55]。

双光子显微镜出现以后，缺血区域可以达到脑内500～1 000 μm处，进一步发展了缺血模型技术，其原理是运用高能量超短脉冲波的入射光线，诱导血浆离子化，导致空间有限的机械能量释放，损伤内皮细胞，产生血块级联反应(见图5)。根据刺激能量不同，将会产生3种损伤形式：

图5 光化学和血浆介导的血栓形成[56](A：光化学血栓；B：血浆介导的血栓)Fig.5 Photochemical and plasma-mediated thrombosis[56] (A: Photochemical thrombosis; B: Plasma-mediated thrombosis)

1)血管破裂：在高能量下产生，血管壁发生破裂，导致血浆和红细胞流到血浆中，表现为产生球形的黑洞，黑洞里面为红细胞，外围是凝固血浆包绕。

2)外渗：运用较低的刺激能量，使得血管中某些成份渗透到血管壁外，血管内血流速度不变。

3)血栓：在外渗的基础上，通过增加脉冲能量和脉冲数目刺激血管，使血管腔膨胀，红细胞运动停止，引起血栓。血栓形态表现为血管内为没有荧光的红细胞，血管外为有荧光的血浆包围(见图6)。

图6 超短脉冲激光诱导的3种脑中风动物模型[57](右侧图像从上到下分别为血管破裂(出血)、外渗和血栓)Fig.6 Shematic diagram of three animal models of stroke induced by ultrashort pulse laser[57] (The right images are vascular rupture (bleeding), extravasation and thrombosis)

利用双光子显微镜形成的光血栓应用广泛，在转基因老鼠脑内形成微血栓后，能够对树突等神经结构进行数日观察，现已经成为评价神经结构的主要方法[58]，同时也用来研究血栓对周围血流的影响[59]、心脑血管药物的作用[60-61]、小胶质细胞的迁移和形态变化[62]、钙信号变化及相应机制[63]等。

3 总结与展望

双光子显微镜技术正在与许多新技术迭代发生演化，应用到更多新的生物医学领域。在脑科学快速发展的时代，双光子显微镜在脑功能研究中越来越展示其独特优势。笔者从双光子显微成像技术在脑微血管网络结构、血流灌注、血氧代谢、白细胞-内皮相互作用以及中风模型构建进行了论述，展示了双光子显微镜在研究脑微循环功能中具有的多个优势，包括：

1)高分辨可视化单根血管及其周围细胞；

2)探测穿透深度可达到脑内500 μm；

3)可实现同步检测单根血管内血流速度、管径和微血管内红细胞和白细胞的运动特性；

4)有助于构建缺血性脑组织损伤模型，以及构建有助于研究阿尔兹海默症的模型；

5)有效减少光漂白、光毒性，有助于对活体动物脑组织微循环进行长时程观测或跟踪；

6)有助于通过活体成像，对清醒小鼠皮层深处的微血管进行微血流动力学研究[64]。

利用双光子显微镜技术进行清醒动物微循环血流动力学的研究已经成为新趋势。由于清醒动物能够维持正常的生理代谢，所以研究结果也更加真实可靠，但目前仍存在成像重复性差、动物容易死亡等问题，对其有效应用构成较大挑战。上述问题可通过开发稳定性更好的活体动物固定装置得到改善。与共聚焦显微镜相比，双光子显微镜串色现象更为明显，目前的解决方法是配置两个飞秒激光器，利用不同波长的红外光激发不同染料。该方法虽能有效地减少串色，但整套装置价格较高。另外，开发荧光信号更强、激发和发射范围更小的双光子荧光染料，也是减少串色问题的发展趋势。

诸多研究表明，借助双光子显微镜技术开展脑内微循环血流检测，并与脑神经科学相结合，对于开展脑科学研究有着广阔的应用前景，为缺血性脑中风、老年痴呆、糖尿病等重大疾病领域的机制研究提供实验依据，也为开发防治心脑血管疾病、保护脑循环系统功能的新型药物开辟广阔的市场。