高甲基化CD36基因对老年中晚期肺癌患者病情进展的影响

江山 李辉 邓智霞 谢寒丹 蓝楠

肺癌是死亡率较高的恶性肿瘤之一，其发病的原因有多种，其中最危险的因素是吸烟，吸烟量与肺癌之间存在着明显的量-效关系，被动吸烟或环境吸烟也是肺癌的病因之一；工业生产中接触与肺癌发病有关的特殊物质，如石棉、煤焦油、烟草的加热产物及铀、镭等放射性物质衰变时产生的电离辐射和微波辐射等可使肺癌的发生风险增加[1]。与交通相关的石油、煤等燃烧后产生的致癌烃等有害物质污染大气也会促使肺癌的发生[2]。在临床治疗中，由于肺癌的症状具有较强的隐匿性，通常在发现时患者已处于病情发展的中晚期，此时及时准确判断病情十分重要。CD36是B类清道夫受体家族的成员之一，是跨膜糖蛋白的受体，在毛细血管内皮细胞、血小板和巨噬细胞表面都有表达，能够与脂蛋白、丝氨酸磷脂和血小板反应蛋白-1等配体相结合从而发挥不同的功能[3]。CD36基因甲基化表达对肺癌患者的诊断及判断分期和预后具有一定价值。本研究对比老年中晚期肺癌患者甲基化CD36基因表达情况，探讨高甲基化CD36基因对老年中晚期肺癌患者病情进展的影响。

1 材料与方法

1.1 临床资料选择我院收治的62例老年中晚期肺癌患者，按病情进展情况将其分为A组（Ⅲ期患者）和B组（Ⅳ期患者），每组31例。其中A组男15例，女16例，年龄55～75岁，平均（61.02±6.32）岁，腺癌11例，鳞癌14例，小细胞癌6例；B组男17例，女14例，年龄52～82岁，平均（61.56±5.64）岁，腺癌10例，鳞癌16例，小细胞癌5例。

1.2 纳入标准出现面部颈部水肿、声音嘶哑、胸闷气短等症状；经病理检查确定肿瘤已处于中晚期；年龄大于50岁；临床资料完整；同意接受本研究所涉及的相关检查，配合研究；签署知情同意书。

1.3 排除标准其他恶性肿瘤；自身免疫系统疾病；颅内转移；有肝肾功能异常、凝血功能障碍。

1.4 方法CD36基因检测：进行初次治疗前，患者均在空腹状态下进行凝血功能测定后，抽取5ml血液留用，以CD36FTTC/TSPPE对全血进行双标记染色， 染色基质为2%PBS液，染色在暗环境下操作，染色结束后使用终浓度1%PFA固定待测。使用Attune NxT流式细胞仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司生产]进行测定，对仪器进行调试后，以前向角和侧向角散射光形成的对数散点图在血小板位置设定收集门，以固定条件收集样本。每个样品管收集104个血小板留待分析。使用Macintosh Quadra 650计算机和Cell Quest软件对样品数据进行收集处理。设置机器测试条件为FSC电压E00，增益1.00，对数，SSC电压347mV，对数；FL1电压674mV，对数；FL2电压517mV，对数；荧光补偿FL1-0.8%FL2，FL2-24.6% FL1；激光功率15mW，激发光波长488nm。

肿瘤标志物检测：两组患者均接受常规抗肿瘤治疗，于初次治疗前及第1个治疗周期结束后分别进行血清检测。在患者空腹状态下抽取5ml血液储存于-80℃环境中保存待用，使用Avanti J-E多用途高效离心机（美国贝克曼库尔特公司生产），以 1 500r/min的速度对血液离心15min，离心血液时间和采血时间间隔应不超过30min，离心结束后取上清液用全自动血液分析仪（美国贝克曼库尔特公司生产）对CYFRA 21-1、NSE、CEA进行检测。

1.5 统计学方法采用SPSS 21.0软件分析数据，计量资料用±s表示，采用t检验，计数资料用%表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血小板粘附蛋白情况比较A组患者血小板数量和CD36基因表达量明显低于B组患者，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 两组患者血小板粘附蛋白情况比较（±s）

表1 两组患者血小板粘附蛋白情况比较（±s）

组别 n 血小板数 CD36表达平均荧光道数CD36-TSP+ CD36+TSP+ CD36+TSP- CD36-TSP+ CD36+TSP+ CD36+TSPA组 31 43.93±15.45 726.87±137.62 8762.13±534.45 35.13±15.22 197.30±95.15 201.94±51.41 B组 31 35.08±12.24 798.46±126.25 9439.73±514.96 27.80±10.06 242.15±58.88 232.90±53.34 t 2.500 2.134 5.083 2.237 2.232 2.327 P 0.015 0.037 0.000 0.029 0.029 0.023

2.2 两组患者CD36基因甲基化情况比较A组患者CD36基因甲基化率明显低于B组患者，差异有统计学意义（P<0.05），但两组半甲基化和完全甲基化对比差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 两组患者CD36基因甲基化情况比较[n（%）]

2.3 治疗前后两组患者血清肿瘤标志物水平及CD36基因甲基化率比较治疗前及治疗后两组患者血清肿瘤标志物水平及CD36基因甲基化率差异均有统计学意义（P<0.05）；治疗后两组患者血清肿瘤标志物水平及CD36基因甲基化率均明显下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 治疗前后两组患者血清肿瘤标志物水平及CD36基因甲基化率比较

3 讨论

肺癌是对人类生命造成严重威胁的疾病之一，具有较高的死亡率，引起肺癌的原因较多，预防难度较大，而且肺癌患者常伴有咳嗽、咯血、发热、胸部疼痛、胸闷气急、声音嘶哑等症状，对患者的生活质量造成严重影响[4]。老年肺癌患者身体机能逐渐退化，面临多重疾病困扰，因此身体出现异常状况时难以引起重视，就诊时病情往往已发展至中晚期，容易对治疗失去信心[5，6]。及时准确判断患者病情有利于制定针对性治疗方案，树立患者治疗信心。近年来随着环境及生活方式改变，肺癌的发病率呈较为明显的上升趋势，对肺癌患者的诊断主要有病理、影像学和免疫学等检查方式，随着医疗技术的不断发展，检测方法也逐渐丰富[7]。

随着对癌症发病机制研究的不断深入，发现基因的表达对癌症病情的预测和判断具有重要作用。中晚期肿瘤患者通常会出现广泛的血小板激活，激活的血小板会使粘附分子表达和释放的产物随之增加，进而引起血液出现高粘高凝状态。血小板能够通过癌细胞循环运输、癌细胞随血细胞栓子粘附在血管内皮表面、癌细胞移出血管壁浸润及癌细胞增殖形成转移灶等促进肿瘤细胞发生转移，血小板的激活状态与肿瘤患者病情发展存在明显关系[8，9]。 CD36是一种存在于多种细胞表面且能够与多种细胞因子结合从而产生不同生理功能的基因，其配体有胶原蛋白、长链脂肪酸（Long chain fatty acid，LCFA）、抗血管发生因子血小板反应蛋白（TSP-1）以及氧化修饰的低密度脂蛋白。粘附于血管内皮的CD36受体与TSP-1相结合会使血管内皮细胞发生凋亡从而起到抗血管发生的作用。其发生过程是CD36受体通过Type-1与TSP-1进行结合，将酪氨酸蛋白激酶、P59、细胞分裂活化蛋白激酶P38依次激活，进而促进凋亡蛋白酶3的表达，引起细胞凋亡[10，11]。此外，CD36在巨噬细胞上表达会受到包括巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）在内的细胞因子和过氧化物酶体增殖因子激活受体（PPAR）的调节。CD36在正常动脉壁巨噬细胞上的表达很低，当肿瘤细胞出现转移时会呈现较高的表达。

基因甲基化是最早发现并进行深入研究的表观遗传调控机制之一，能够在不改变基因序列的前提下使基因的遗传表观得以改变，在甲基酶的作用下使基因的染色体结构和作用方式发生改变，从而达到控制基因表达的目的。在癌症患者中，抑癌基因的高甲基化已成为癌症发展的重要判断参数，在癌症发展进程中，大量基因被沉默或激活使基因表达失常从而促进癌症发生，所以基因甲基化检测能够对癌症的发生进行预测以及对病情发展进行判断[12]。基因甲基化状态是肿瘤发生的一种敏感指标，当癌细胞产生时会释放DNA到外周血中，在血清和血浆中表现尤为富集，此外在人体肿瘤细胞累及的相关体液中也能检测出肿瘤相关基因的异常甲基化，如唾液和痰液等，这些生物样品在收集过程中更加容易获得，因此相较于其他肿瘤发生和发展标志物，基因甲基化的检测更加容易被接受且能够提供具有价值的信息[13，14]。此外，在不同肿瘤中某一基因的甲基化区域通常是一样的，在检测时也更加方便，容易与正常组织中的阴性背景进行 区分。

由于基因甲基化变化在癌症病情发展中具有较为明显的作用，因此对癌症患者的治疗措施也能够以此为出发点进行选择，基因去甲基化的机制包括主动去甲基化和特定位点的去甲基化，基于基因甲基化的可逆性可将高甲基化基因作为癌症治疗的重要靶点，使用药物促使其恢复表达。肿瘤细胞转移是导致患者病情恶化的重要原因之一，肿瘤细胞可通过侵犯脏层胸膜、癌细胞脱落进入胸膜腔，形成种植性转移，癌细胞随肺静脉回流到左心后，可经过血行转移转移到体内任何部位，此外，淋巴道转移是肺癌最常见的转移途径，肾脏、消化道、骨组织和中枢神经系统等也是肺癌细胞转移的通道和途径。因此对患者血清肿瘤标志物进行检测能够有效判断患者发生转移的风险，同时还能掌握患者病情发展状况。目前临床上还未发现对肺癌具有特异性的标志物，与之相关的研究较多。陈从华等[15]研究指出CYFRA 21-1、NSE、CEA与肺癌患者出现复发转移及其预后状况存在密切关系。本研究结果显示，不同病程分期患者血清肿瘤标志物水平有明显差异，且治疗后血清肿瘤标志物水平下降。此外，治疗前后两组患者CD36基因甲基化率也存在明显差异，且治疗后两组患者CD36基因甲基化率下降，说明治疗对患者基因甲基化水平存在影响，提示对CD36基因甲基化表达进行调控有望实现肿瘤控制。去甲基化药物在改变基因甲基化表达的同时还能够抑制肿瘤细胞产生和转移以达到缓解病情的目的。CD36基因的表达强度也可以进行控制，核激素受体超家族中的PPAR被认为是对CD36进行调节的关键性因子，在具有表达缺陷的巨噬细胞上原来对CD36进行上调的激动剂在PPAR的作用下已不能再诱导CD36产生，此外，PPAR能够与黄醇类似物X受体（RXR）结合形成异源二聚体，对脂代谢和多种蛋白的形成起到转录调节作用[16]。当然，并不是所有细胞中的PPAR都对CD36具有主要调节作用，如在心肌细胞中CD36的表达就只对PPAR的激动剂产生反应，在骨骼肌和心肌细胞中CD36表达的改变也与LCFA的水平存在关系。由于CD36配基的多样性，临床中研究相关调节药物时需要对其是否会引发副作用进行慎重考虑，噻唑阮二酮（TZD）类胰岛素增敏药物能够对巨噬细胞上CD36的表达进行调节，但是也会引起肝X受体（LXR）激活并增加ATP结合盒转运体AI（ABCAI）所调节的胆固醇流出，最终可以达到相对平衡的状态[17，18]。而他汀类药物能够通过抑制巨噬细胞CD36的表达发挥作用[19，20]。这为中晚期肺癌患者的临床治疗提供了新的方向，但是其药物应用的合理性和对人体的实用性还需要进行多次实验确定。

本研究结果显示，Ⅲ期老年中晚期肺癌患者血小板数以及CD36基因表达量均较Ⅳ期患者低，血小板活化时TSP的分泌能够使其局部浓度得到显著提高，对肿瘤转移具有明显的促进作用，老年中晚期肺癌患者的血小板呈现明显的广泛激活状态，且随着病情的发展具有明显差异，因此CD36基因的表达对中晚期肺癌患者病情判断具有重要作用。此外，CD36基因的高甲基化表达在老年中晚期肺癌患者的病情发展中具有明显差异，CD36基因甲基化率较高，而Ⅳ期患者又明显高于Ⅲ期患者。因此说明高甲基化CD36基因对老年中晚期肺癌患者病情的发展具有明显作用，且可以将其作为治疗的重点靶向。两组半甲基化和完全甲基化对比差异无统计学意义（P>0.05），但数据存在差异，有待积累更多样本进行验证。

综上所述，CD36基因高甲基化表达对老年中晚期肺癌患者的病情发展具有明显影响，在临床治疗中可通过探究其生理机制进行针对性药物研究，对CD36基因表达进行调控，从而抑制肿瘤产生和转移，进而对病情起到控制作用。