调节性T细胞在肿瘤放疗联合免疫治疗中的研究进展

郭茹玥，韩高华

1大连医科大学研究生院，辽宁大连116044

2泰州市人民医院肿瘤科，江苏泰州225300

放疗是治疗恶性肿瘤最常用的一种手段，主要是通过直接辐射诱导肿瘤细胞凋亡，对肿瘤患者生存率的影响通常表现为局部控制肿瘤，减少全身转移。研究发现，放疗除了直接损伤肿瘤细胞外，还可改变肿瘤微环境，诱导具有治疗意义的抗肿瘤免疫反应，同时也激活了免疫抑制途径，肿瘤放疗后的疗效与免疫网络密切相关。辐射肿瘤微环境可观察到多层次调控，包括肿瘤血管系统损伤、免疫微环境改变、调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）浸润增多等。在各种类型的肿瘤中，Treg细胞的高浸润与低生存率有关，可使多种免疫细胞失活、凋亡，为肿瘤细胞的生长浸润提供庇护所。因此，需要寻找最佳的治疗方法减少Treg细胞或减弱其在肿瘤组织中的抑制活性，同时激活肿瘤特异性效应T细胞，提高放疗的抗肿瘤免疫反应。

1 Treg的概述

Treg细胞是一类抑制性T细胞的功能亚群，最早追溯到1970年就有研究者提出抑制性T细胞这一概念，1980年有学者在小鼠模型中证实了该细胞具有免疫抑制的作用，1995年Sakaguchi等正式确认其作用并发表报道。目前许多不同类型的Treg细胞已被鉴定，最突出的类型是自然发生在胸腺的Treg（natural Treg，nTreg）和外周诱导型Treg（induced Treg，iTreg）。

胸腺T细胞在成熟阶段开始表达T细胞受体（T cell receptor，TCR）序列，通过阳性和阴性的选择产生有功能的T细胞识别外来抗原发挥其免疫功能。阳性选择的目的是使那些表达TCR识别自身（或宿主）主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子的T细胞存活下来，阴性选择主要导致与自身MHC-抗原肽亲和力高的T细胞被排除。然而，一些具有自身反应性TCR的T细胞在与具有高亲和力的自身抗原肽相互作用后可以发育成Treg。这种自然发育的Treg占外周CD4T细胞群的5%～10%，并以CD25的高表达和CD45RB亚型的低表达水平为特征，在维持自我免疫耐受和调节免疫反应中发挥着重要作用。iTreg主要来源于外周免疫系统中的CD4T细胞，其形成较为复杂，决定iTreg细胞发育的关键因素包括抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）的类型、分化状态以及激活过程中的细胞因子环境。肿瘤浸润性树突状细胞在分化的未成熟阶段被阻断并具有耐受性，可以刺激Treg细胞分化，转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、吲哚胺-2，3-双加氧酶-1（indoleamine 2,3-dioxy-genase 1，IDO-1）等也可明显促进CD4T细胞向Treg细胞分化。

2 Treg介导的免疫抑制

Treg细胞是外周对自身和非自身抗原耐受的重要介质，通过多种抑制机制实现这种免疫调节控制。①细胞接触依赖机制：Treg细胞表面可表达特异性蛋白分子——叉头框蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3）、细胞毒T淋巴细胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）、TGF-β、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）等。FOXP3是Treg细胞产生、维持免疫抑制功能的主要调控基因，在原始T细胞中表达FOXP3可导致机体发生免疫抑制。研究发现，具有FOXP3基因移码突变的小鼠由于缺乏Treg细胞可使效应T细胞活化增加，转染FOXP3的CD4CD25原始T细胞可转化为CD4CD25Treg细胞，产生抑制性细胞因子并表达主要的Treg细胞表面分子，如CD25、CTLA-4、TGF-β、GITR等，这些分子的具体免疫抑制机制将于下文提到。②分泌抑制性细胞因子：Treg细胞通过分泌包括TGF-β、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和白细胞介素-35（interleukin-35，IL-35）等抑制性细胞因子显示其抑制活性。TGF-β、IL-10主要通过抑制树突状细胞和效应CD8T细胞的功能并促进CD4T细胞转化为Treg细胞发挥作用；IL-10可影响巨噬细胞的分化削弱其杀死肿瘤细胞的能力，其受体缺失的Treg细胞无法维持FOXP3的表达；IL-35是Treg细胞分泌的一种新型免疫抑制分子，在进入组织后通过“感染耐受”使接触到的非Treg细胞具备抑制其他细胞的能力。③肿瘤微环境中特定代谢产物如IDO-1、腺苷的局部积累可抑制效应T细胞，促进Treg细胞增殖。肿瘤细胞糖酵解代谢的加速导致葡萄糖的消耗和脂肪酸的增加，脂肪酸代谢促进Treg的发育。④Treg细胞通过分泌穿孔素、颗粒酶A/B等对B细胞、自然杀伤T细胞（natural killer T cell，NKT）产生抑制作用，此外Treg细胞还能抑制Ⅱ型固有淋巴细胞、NKT细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞和嗜酸性细胞的激活。

3 放疗对Treg的影响

作为临床上常用的一种治疗方法，放疗主要通过直接杀伤肿瘤细胞、阻断肿瘤血管再生及改变肿瘤免疫微环境等发挥其对恶性肿瘤的杀伤效应，后者表现为射线杀伤肿瘤细胞以后释放抗原物质进入肿瘤微环境中，激活树突状细胞并加强APC的呈递，动员抗肿瘤免疫细胞前往肿瘤组织发挥肿瘤特异性免疫反应。然而放疗在激活抗肿瘤免疫的同时，也可产生免疫抑制作用，这种作用可能与放疗引起Treg细胞增加、肿瘤细胞表面程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）上调、骨髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）浸润、树突状细胞功能受损等有关。放疗对Treg的影响是多方面的。①放疗引起Treg细胞数量改变：放疗可使所有T细胞增殖，其中Treg细胞最为显著。Anderson等首先发现，放疗可致Treg细胞增多，且这部分细胞在放疗后仍具有免疫调节功能。Muroyama等进一步发现放疗后Treg细胞的Ki-67染色增加了自身增殖，明显使肿瘤微环境中的Treg细胞增多，且CTLA-4、CD137和转录因子Helios的表达均高于非放射肿瘤。②放疗剂量对Treg细胞的影响：一项数据显示，单剂量或分次剂量2 Gy的局部放疗可导致脾脏内Treg细胞增加，将剂量增加到20 Gy可使肿瘤浸润Treg细胞的比例增加一倍。然而也有一些学者发现，随着照射剂量的增加Treg细胞呈剂量依赖性凋亡，许多因素可能导致这些研究的不同结果，如辐射剂量的差异、放疗后的评估时间、局部照射与全身照射的差异以及肿瘤与非肿瘤模型的差异。虽然已经有许多研究表明放疗可使Treg细胞数量增多，但不同剂量对其数量变化的影响目前仍有争议。③放疗对Treg细胞表型和功能产生影响：Cao等发现γ射线辐射后Treg细胞上CD62L、FOXP3、CD45RO、TGF-β表达降低，GITR及凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白（B cell lymphoma/leukemia-2-associated X protein，BAX）表达增强，这些表型通过剂量依赖型减弱了Treg细胞对自身T细胞的抑制能力并诱导了自身凋亡。Beauford等进一步发现放疗以剂量依赖的方式下调了Treg细胞上的FOXP3、CD25和CTLA-4表达，诱导淋巴细胞激活基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG3）的表达升高，使其抑制CD8T细胞增殖的能力减弱。这两个实验证明了放疗可能通过改变Treg细胞的表型影响其抑制功能，且这种改变与照射剂量及分割模式有关。

4 Treg细胞对放疗疗效的影响

Treg细胞是免疫系统的重要组成部分，与传统放疗的相互作用可能从根本上影响肿瘤治疗的疗效。淋巴细胞是放射敏感性最高的细胞，其次是单核细胞、巨噬细胞和APC。即使淋巴细胞是对电离辐射特别敏感的细胞，但单个淋巴细胞亚群的辐射敏感性存在很大的差异，Treg细胞比其他T淋巴细胞或B淋巴细胞亚群更具抗辐射性，其抗辐射作用部分是由促凋亡蛋白下调和抗凋亡蛋白上调介导的，TGF-β存在于肿瘤微环境中也可能有助于肿瘤内T细胞的放射抗性。在肿瘤环境中，Treg细胞与放疗疗效呈负相关，一方面放疗促进了Treg的分化与增殖，另一方面Treg通过其抗辐射及抗肿瘤免疫抑制作用，使肿瘤细胞逃避免疫杀伤，影响放疗的疗效。

5 放疗联合Treg相关免疫治疗的研究进展

基于上文所述，单纯放疗所诱发的免疫增强作用是很弱的，并不足以抗衡放疗诱导Treg的免疫抑制作用，总体上放疗对Treg细胞的分化、增殖起到促进作用，诱导了免疫抑制，影响放疗的疗效。随着靶向免疫治疗日益增多，放疗联合免疫治疗引起越来越多的关注，Treg细胞已成为当前联合治疗的重要靶点。

5.1 抗CTLA- 4单抗联合放疗

CTLA-4是目前研究最多、临床应用最广泛的一个靶点，是Treg细胞表面的抑制性受体。尽管Treg细胞可通过多种途径抑制体内免疫功能，并且每种途径可能因环境和免疫环境的不同而不同，但是在CTLA-4介导的途径存在缺陷的情况下，即使其他抑制机制更加活跃以弥补该缺陷，Treg也难以维持其自身耐受和免疫稳态。因此，CTLA-4是T细胞应答的一个重要的负调控因子，并且是在生理和病理免疫反应（包括自身免疫、过敏和肿瘤免疫）中控制Treg抑制功能的关键分子靶点。CTLA-4与B7分子结合可截断B7/CD28通路，此通路是T细胞活化的重要一环，该通路被阻断可使T细胞无法被激活，处于免疫应答失活状态。放疗可上调APC表面的B7-1，由于Treg细胞表面的CTLA-4与B7-1的亲和力更高，导致放疗后更多的表现为免疫抑制。因此为了更好地发挥出抗肿瘤免疫效应，可以在放疗的同时进行抗CTLA-4治疗。目前抗CTLA-4药主要是指Ipilimumab（IPI），它是最早被批准用于临床的针对Treg的靶向药，也是治疗晚期恶性黑色素瘤的首选药物。Rudqvist等在乳腺癌小鼠模型中发现，在对抗CTLA-4单药耐药的情况下，放疗和抗CTLA-4可显著增加肿瘤浸润性淋巴细胞的数量，且改善小鼠的存活率。目前越来越多的报道证实了放疗联合全身免疫治疗的安全性和有效性。Bang等回顾性分析了多种肿瘤在接受放疗联合免疫治疗后，证明了局灶性姑息性放疗与CTLA-4和（或）程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）抑制剂联合使用具有良好的耐受性。Formenti等报道了一项Ⅱ期临床试验的结果，该试验评估了局部放疗和IPI在转移性非小细胞肺癌患者中的疗效，结果显示客观缓解率（objective response rate，ORR）及无进展生存期（progressionfree survival，PFS）均优于历史上报道的单独使用IPI。Ji等发现与单独放疗相比，抗CTLA-4联合放疗使肿瘤消退明显，且显著改善临床结果。

5.2 抗GITR单抗联合放疗

Treg细胞上的另一热门靶点是GITR，其是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）受体蛋白家族的一员，在调节性细胞上结构性表达，效应T细胞上诱导表达的共刺激受体。研究表明，GITR与GITR配体相互作用可为CD4和CD8初始T细胞提供共刺激信号，激活效应T细胞，同时抑制Treg细胞的抑制活性。近年来，GITR作为一个有前景的靶点得到了广泛的研究，激动剂GITR单抗通过增加效应T细胞活性、减少Treg细胞浸润增强抗肿瘤反应。Patel等的小鼠胶质瘤模型实验结果显示，抗GITR单抗联合放疗提高了瘤内CD4T细胞/Treg细胞比例，促进了肿瘤消退，并显著提高生存率。然而，近几年抗GITR单抗联合放疗相关文献报道较少，有待进一步观察GITR对辐射增敏的效果。

5.3 抗CD25联合放疗

CD25抗原是分子量为55 kD的单链糖蛋白，又称IL-2受体，主要表达于活化的T细胞，其配体IL-2是CD8CTL细胞扩增所必需的。Treg细胞可表达更高亲和力的IL-2受体，在肿瘤微环境中超过效应T细胞以获得有限的IL-2，并获得比效应T细胞更大的增殖优势，进一步促进免疫抑制。Oweida等的动物实验显示，与单纯放疗相比，抗CD25治疗联合放疗可增强T细胞的细胞毒性，诱导肿瘤抗原特异性记忆反应，使57.1%的小鼠肿瘤消失。Ji等进一步证明放疗联合抗CD25单克隆抗体较单纯放疗在肿瘤中降低Treg，并逆转了放疗时肿瘤CD8T细胞和CD4T细胞上PD-1表达增加，抑制了局部放疗及远处未放疗肿瘤生长，提高总生存率。然而，也有一些类似研究未能获得临床明显的增强作用，可能的原因是由于活化的效应T细胞也表达CD25，基于CD25的细胞耗竭也可能减少活化的效应T细胞，从而减弱Treg细胞耗竭增强的抗肿瘤免疫作用。考虑到单克隆抗体的给药时间和剂量也可能是肿瘤免疫中Treg细胞和效应T细胞差异控制的重要因素，因此如何更好地减少Treg细胞又不消耗特异性效应T细胞是进一步需要解决的问题。

5.4 IDO抑制剂联合放疗

IDO-1是机体内天然存在的免疫调节酶，大量的研究发现许多潜在的免疫抑制机制，其中主要机制为微环境中的色氨酸消耗。近年来，人们逐渐认识到肿瘤与色氨酸分解代谢升高之间的关系，色氨酸通过IDO限制酶代谢为犬尿氨酸，使效应T细胞的细胞周期阻滞和（或）失能，同时促进Treg细胞的成熟和激活，在肿瘤免疫逃逸中发挥直接作用。针对该通路的IDO抑制剂近年来进行了火热的研究，Zhu等发现放疗对IDO免疫活性的影响具有剂量依赖性，因此在放疗时使用IDO抑制剂可以通过逆转T细胞衰竭延缓肿瘤生长。Liu等发现IDO抑制剂与放疗协同可以下调Treg细胞，激活树突状细胞和效应T细胞，这种联合治疗可以增强抗肿瘤免疫并抑制肿瘤进展。

5.5 双重免疫联合放疗

双重免疫和放疗的联合应用通过针对免疫逃逸的多种机制增强抗肿瘤免疫反应，比任何单双疗法更能提高生存率。PD-1是Ⅰ型跨膜糖蛋白，1992年首次被发现，主要在活化的T细胞表面表达，其配体PD-L1表达于多种类型细胞如APC、巨噬细胞、肿瘤细胞等，正常情况下两者结合可使T细胞持续活化状态中止，防止机体发生自身免疫性疾病，病理情况下PD-L1在肿瘤细胞中的表达明显高于其他正常细胞，两者结合抑制了抗肿瘤T细胞活化，促进肿瘤生长。已有多项研究表明，放疗联合抗PD-1/PD-L1治疗可以显著延缓肿瘤生长。Twyman-Saint等通过一项针对转移性黑色素瘤的临床试验及小鼠模型实验发现，IPI联合放疗可使肿瘤消退明显，但耐药性很常见。抗CTLA-4主要是通过抑制Treg细胞从而增加Teff/Treg比例，而放疗可使肿瘤细胞表面受体上调，因此其耐药性可能是由于PD-L1在黑色素瘤细胞中上调，导致T细胞耗竭。该临床试验结果证实了高PD-L1对放疗联合抗CTLA-4无反应，黑色素瘤细胞上的PD-L1可以使肿瘤逃避基于抗CTLA-4的治疗。这些数据显示了抗CTLA-4、抗PD-1/PD-L1、放疗三者联合应用的必要性，主要是通过激活不同途径增强抗肿瘤反应并实现持久的肿瘤应答。还有更多的三联组合正在被研究，Schoenhals等发现抗GITR、抗PD-1和放疗显著改善小鼠存活率和局部反应，其中半数小鼠无肿瘤，且这些小鼠的CD4和CD8效应记忆细胞增多。另外在一些临床前实验中，抗TGF-β、抗PD-1联合放疗也显示出良好的抗肿瘤效果。这些数据揭示了双重免疫治疗联合放疗克服肿瘤耐药的潜力。

6 小结与展望

本综述回顾了Treg的起源、作用以及运用于临床治疗中的研究进展。放疗是目前治疗肿瘤的重要方法，射线在照射病灶的过程中使机体的免疫功能受到破坏并影响疗效，Treg细胞参与了其免疫失能过程。目前已有越来越多的证据表明放疗联合抗Treg治疗可逆转其诱导的免疫抑制，增强放疗疗效，因此针对Treg细胞的研究已成为当前放疗联合免疫治疗的突破点和热点，寻找更多的Treg抑制剂及如何有效将清除/逆转Treg与放疗最优化联合，是今后关注的重点。