分子动力学模拟揭示C677T诱导MTHFR及其配体FAD解离的分子机制

王若男 曹锟

摘要：亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T的基因多态性会影响叶酸代谢。为了研究C677T（A177V）对于该酶构象的影响，我们采用分子动力学模拟的方法，针对MTHFR-野生型（MTHFR-WT）和A177V突变体分别进行了100 ns的模拟计算，分析了该酶整体构象差异及其FAD活性中心的变化。研究发现，与MTHFR-WT相比，A177V模拟体系无法趋于稳定，突变体a-C的均方根涨落值升高，回旋半径值增大，溶剂可及表面积增大，这些结果都表明，A177V突变会导致该酶的整体结构松散且不稳定升高;进一步的二级结构含量及FAD活性中心的分析表明，A177V突变会引起部分a螺旋含量降低、b折叠含量升高，且造成FAD结合位点残基的空间距离增大，这些结果表明A177V突变会破坏FAD结合位点微环境。本研究在原子水平揭示了A177V突变会诱导MTHFR激活剂FAD解离的关键信息。

关键词：分子动力学模拟;亚甲基四氢叶酸还原酶;黄素腺嘌呤二核苷酸;突变体;稳定性

亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR是机体叶酸代谢过程中的关键限速酶，它能催化5，10-亚甲基四氢叶酸向5-甲基四氢叶酸转换，随后会进入甲基传递通路，为DNA、蛋白质甲基化提供甲基，为同型半胱氨酸提供甲基形成甲硫氨酸。叶酸是人体体内重要的水溶性维生素B族营养素，是对具有蝶酰谷氨酸分子结构化合物的总称[1-2]。叶酸在细胞分裂、蛋白质合成等途径中具有重要作用，叶酸摄入不足或者代谢障碍，可能造成人体同型半胱氨酸积累、血红蛋白生成减少进而导致贫血，甚至可能导致神经管畸形、智力低下、心脑血管等疾病[3]。

MTHFR C677T具有基因多态性，这直接决定了酶活性以及叶酸利用率。根据文献报道，与MTHFR-WT相比，C677T基因突变会造成该酶的熔解温度下降6℃且酶活性仅有26%，从而引起叶酸、甲基代谢紊乱，所以该酶参与了人类重要疾病的发生发展[4]。本研究项目将通过分子动力学模拟的手段揭示C677T对于该酶构象的影响，并阐明其诱导FAD配体解离的分子机制。

1材料与方法

1.1分子模拟的条件

本研究中大肠杆菌MTHFR的结构（PDB：1b5t）来自于RCSB蛋白质数据库（https：//www.rcsb.org/）。在使用Gromacs2020.4软件进行分子模拟计算之前，需要先除去MTHFR结构中的结晶水和杂质离子，此后需要通过PymoL软件将Ala-177突变成Val-177，即A177V。针对MTHFR和A177V设置两个独立的体系，采用SPC水模型、Gromos43a1力场进行总时长为100 ns模拟[5-6]。将MTHFR和A177V的晶体构象放置在立方周期盒中并作为起始构象，将蛋白与盒子边界的最小距离设定为1.0 nm，模拟系统的周期性边界条件适用于X/Y/Z三个方向。在溶胶中加入0.15 mol/L NaCl盐溶质以便于中和蛋白体系的电荷。接下来，采用蛙跳算法计算每个原子的运动，用粒子网格法计算PME静电相互作用。我们利用最速下降能量法进行400步能量最小化，并对MTHFR和A177V的模拟体系进行了50 ps的位置约束仿真。采用随机初始速度作为正式动力学模拟的初速度。利用PyMOL、VMD以及Origin8.5软件生成数据结果。

1.2模拟结果的分析

我们利用VMD-1.9.1软件观察两个不同模拟体系的轨迹中蛋白构象变化[7]，采用gmx rms、gmx rmsf和gmx gyrate工具分别计算了蛋白的RMSD变化、每个氨基酸残基的a-C的均方根涨落RMSF以及回旋半径[8]。并采用gmx distance分别测量了MTHFR和A177V中的典型FAD结合位点残基的平均距离。并用PyMOL绘制结构图，用Origin8.5软件绘制曲线图。

2 结果与分析

2.1 MTHFR-WT与A177V的整体构象变化

大肠杆菌MTHFR酶的三维构象主要呈现桶状结构，由296个氨基酸残基组成，其分子量约为33.1 kDa。其中，Ala-177与人类MTHFR中的Ala222相对应，位于桶底附近，远离FAD。大多数a-螺旋位于桶的外侧周围，主要作用是向内形成一个疏水囊;而桶的内部是辅酶因子FAD的主要活性区域，由7个b-折叠形成疏水区域，这对于稳定蛋白的整体构象至关重要。

均方根误差（root mean square deviation，RMSD）是衡量体系是否达到平衡状态的重要依据。MTHFR-WT在70 ns即达到平衡狀态，对应的平均RMSD值最低约为3.6 Å（图1A）;而A177V突变体蛋白的RMSD值在100 ns的总模拟时间内无法达到平衡状态，其RMSD最大值高达4.3 Å以上，说明Ala-177残基被突变成Val-177会导致蛋白结构不稳定。

通过对比MTHFR-WT与A177V中每个a-C原子相对于其平均位置的涨落（RMSF）值的变化，能够直观反应出Ala-177突变引起的残基柔性差异。通常情况下，RMSF值越低则该残基的灵活性越小，我们将MTHFR-WT的RMSF值定义为正常值;与正常值相比，A177V突变体的多数残基的RMSF值增大，这表明Ala-177的突变已经对蛋白的碳骨架的波动性造成较大影响（图1B）。因此，这些结果都表明A177V的突变会导致多数残基的波动性增大，甚至造成蛋白构象不稳定性，这不利于蛋白发挥酶活性。

2.2 蛋白的回旋半径及其构象的溶剂可及表面积分析

接下来，我们统计了MTHFR-WT及其突变体的回旋半径（Rg）随模拟时长的变化情况，蛋白的Rg值越大表示蛋白构象越灵活，该值越小说明构象越趋近于刚性。在MTHFR-WT和A177V的体系中，蛋白样品a-C的Rg值分别为1.77 nm和1.81 nm（图2A）。接下来，我们采用gmx sasa分别计算了蛋白整体的溶剂可及表面积SASA随着时间变化情况，平衡状态下的MTHFR-WT所对应的SASA值降低至117.5 nm2，与之相比A177V的SASA值则升高至125.1 nm2（图2B）。这些结果说明，回旋半径与溶剂可及表面积的数据趋势与RMSD及RMSF结果保持一致，即Val-177突变将导致该酶的空间构象由致密变得更加松散，这不利于蛋白构象保持稳定。该结论从原子水平解释了A177V突变体的熔解温度比野生型下降了6℃这一科学问题。

2.3對比MTHFR-WT与A177V的二级结构变化以及FAD的结合能力

为了探究Ala-177被突变成Val-177所引起的二级结构变化差异，我们采用do_dssp插件解析了蛋白的二级结构含量。A177V模拟体系的二级结构改变情况与MTHFR-WT正常体系形成鲜明对比，MTHFR-WT平均有122个残基参与a螺旋的形成，19个形成b-转角（图3A）;然而，在A177V突变体中有125个残基形成a螺旋，17个形成b-转角（图3B）。这些数据表明Ala-177被突变成Val-177可能会导致一部分氨基酸残基由b-转角转化为a螺旋，从而改变了二级结构含量占比。由于MTHFR酶的b-转角具有稳定蛋白骨架的作用，因此b-转角含量的降低可能会破坏其结构稳定性，甚至降低该酶的催化活性，这个结果与文献报道的A177V酶活性仅有26%相一致。

由于FAD是MTHFR酶的底物辅酶因子，接下来我们分析了MTHFR-WT和A177V分别与底物FAD分子的结合位点，经过分析，我们确定了大肠杆菌MTHFR-WT的FAD结合位点残基为Trp-60、His-88、Arg-118、Gly-119、Asp-120、Ala-132、Trp-152、His-156、Asp-165、Asn-168、Arg-171和Lys-172（图3C），由此可见FAD的结合方式极为严苛。然而，上述诸多证据已经揭示A177V突变体的氨基酸残基波动性较大、整体构象趋于松散状态，因此这些结合位点残基之间的空间距离也随之增大（图3D），具体表现在Trp-60和His-88与其他残基之间的距离增大为12.2 Å和15.9 Å，而其余结合位点的空间位置则被压缩，不利于FAD底物分子的结合，这可能是由于氨基酸残基的灵活性较大、局部二级结构被转换导致的结果。总之，这些数据从原子水平证实A177V突变体不利于结合辅酶因子FAD，故无法充分发挥其催化活性。

3 讨论

据文献报道，Brian D.Guenther等人已证实MTHFR-WT的熔解温度大约为53.1 °C，而A177V的熔解温度仅有46.0 °C，并且A177V的酶活性仅为野生型的26%[9-10]，然而这一科学问题并未从原子水平角度被更好的解释。因此，本研究通过分子动力学模拟的手段，探究A177V突变体所造成的蛋白构象变化，具有一定的生物学意义。在这项研究中，我们采用分子动力学模拟的手段分析了MTHFR-WT和A177V突变体蛋白的原子空间构象差异，从RMSD、RMSF、Rg、SASA、二级结构改变及FAD结合能力等方面证实，A177V突变体会引起氨基酸残基的波动性增大、碳骨架的不稳定性升高、蛋白空间构象由致密变得松散等结论，并导致底物分子FAD的活性区域被破坏，最终造成该酶的熔解温度降低以及酶活性降低。在临床病例中，MTHFR的大多数突变属于C677T突变，即形成A177V突变体，这将诱导MTHFR酶无法正常结合FAD配体分子。总之，本研究在原子水平揭示了C677T对于该酶构象的影响，并阐明其诱导FAD配体解离的分子机制。

参考文献

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基金項目：国家自然科学基金青年项目（82002104）;广东省基础与应用基础研究基金项目区域联合基金-青年基金项目（2019A1515 110659）;广东省医学科学技术研究基金项目（A2020381）;2019年度广东医科大学博士学位人员科研启动基金（B2019018）;2020年度广东医科大学科研基金自然科学类面上培育项目（GDMUM2020016）。

*通讯作者：曹锟（1989-），男，助理研究员，博士研究生，研究方向：医学生物化学。

作者简介：王若男（1991-），女，助理实验师，硕士研究生，研究方向：食品科学和生物化学。