超声浸提-离心过滤法测土壤有效磷的探索

王 丹 ，吴佐京通 ，姚华明 ，3，祝贤彬 ，潘红忠

（1.长江大学资源与环境学院，武汉 430100；2.湿地生态与农业利用教育部工程研究中心，湖北 荆州 434000；3.中国长江电力股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

有效磷作为土壤中唯一可被植物吸收的磷态，是衡量土壤中磷含量的一个关键指标。测定土壤有效磷含量对于合理控制施肥时间、提高作物产量及预防水肥流失造成的水体富营养化等具有非常重要的意义［1-4］。目前，有效磷的测定方法主要有 Olsen法、Mehlich3法、ASI法、Bray-Kurtz1和Bray-Kurtz2［5-6］，其中Olsen法的测定值与土壤有效磷含量及植物吸磷量之间相关性最好，是目前使用最广泛的测定方法［7］。我国国标GB 12297—1990《石灰性土壤有效磷测定方法》也推荐采用Olsen法（0.5mol/lNaHCO3pH 8.5）进行土壤有效磷测定。但该法实验过程繁琐、不能实现序批操作、测试效率低。如何提高土壤有效磷的测试效率，仍然是目前亟需解决的问题。

目前土壤有效磷测定改进方法主要集中在浸提剂、波长及显色剂等环节，如杨俐苹等［2］改进了显色剂，调整波长为882nm，结果发现可消除土壤可溶有机质颜色的影响，减少了加无磷活性炭的步骤，降低了二次污染的风险。杜昌文等［8］采用省去样品前处理的傅里叶变换红外光声光谱法测定土壤中有效磷。秦海娜等［9］使用电感耦合等离子体发射谱法测定土壤有效磷。

综上可见，目前土壤有效磷改进方法大多集中在测定仪器上，对于土壤样品前处理过程的优化研究较少。本文在参照GB 12297—1990国家标准的前提下，对国标法前处理环节进行改进，采用超声浸提、离心机离心分离等方法。其中，超声萃取因其具有浸提效率高、操作简单的优点，被用来提取磷石膏中的水溶性磷和有效磷［10］。本研究试图通过设置不同的超声浸提时间和离心转速，找到最合适的浸提时间和离心转速，研究改进法与国标法之间的相关性，以期为提高土壤有效磷测定效率提供理论依据。

1 实验部分

为使样品更具代表性，实验所用的样品分别来自菜地、鱼塘和江边沙地3个不同的地方，因为菜地施磷，施磷可以提高表层土壤速效磷的含量，导致菜地的有效磷含量是鱼塘和江边沙地的10倍左右。实验过程中所用的试剂和样品用量与国标法保持一致。

1.1 土壤样品

土样1 （114°6′7.61″，30°18′1.32″）：来自菜地，颜色呈褐色，其中，砂粒占8.93%，粉粒占60.45%，黏粒占30.62%，电导率为105.3us/cm，TDS为52.7mg/L，pH为7.45，有机物含量为14.38g/kg。

土样3 （114°5′46.19″，30°17′36.96″）：来自江边沙地，颜色呈黄色，其中，砂粒占11.33%，粉粒占64.96%，黏粒占23.71%，电导率为102.2us/cm，TDS为51.1 mg/L，pH为7.48，有机物含量为27.62g/kg。

土样2 （114°6′2.48″，30°17′40.26″）：来自鱼塘，颜色呈黄褐色，其中，砂粒占10.56%，粉粒占66.88%，黏粒占22.57%，电导率为96.2us/cm，TDS为48.1mg/L，pH为7.71，有机物含量为16.08g/kg。

1.2 主要分析仪器和设备

振荡培养箱（浙江美壁仪器有限公司）、超声波清洗仪 （中国上海早盈精密清洗机械有限公司）、L400 Cence湘仪冷冻离心机 （湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、UV-2550紫外分光光度计 （岛津国际贸易有限公司）、玛瑙研钵、分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、1mm方孔筛 （连云港市春龙实验仪器有限公司）。

1.3 试剂和溶液

碳酸氢钠（分析纯）；氢氧化钠（化学纯）：50%（m/v）溶液；碳活性炭（化学纯）；盐酸：1+1溶液；钼酸铵（分析纯）；硫酸（分析纯）；酒石酸氧锑钾：0.3%（m/v）溶液；抗坏血酸（左旋，比旋光度+21°～+22°，分析纯）；磷酸二氢钾（分析纯）。

1.3.1 浸提剂（0.5mol/L碳酸氢钠，pH=8.5）

将42.0g碳酸氢钠溶于800mL水中，稀释至1L，用氢氯化钠溶液调节至pH=8.5（用pH计测定）。储存于聚乙烯瓶中，用塞塞紧，如贮存期超过20d，使用时必须检查并校准pH值。

1.3.2 无磷活性炭粉

如果所用活性炭含磷，应先用1+1盐酸浸泡12 h以上，然后移放在平板漏斗上抽气过滤，用水淋洗4～5次，再用浸提剂浸泡12h以上，在平板漏斗上抽气过滤，用水洗尽碳酸氢钠，并至无磷为止，烘干备用。

1.3.3 钼锑储存液

10.0g钼酸铵溶于300 mL约60℃的水中冷却。另取181mL硫酸缓缓注入约800mL水中，搅匀，冷却。然后将稀硫酸注入钼酸铵溶液中，随时搅匀；再加入100mL酒石酸氧锑钾溶液；最后用水稀释至2000mL，盛于棕色瓶。

1.3.4 显色剂

0.50g抗坏血酸溶于100mL钼锑贮备液中。此试剂有效期在室温下为24h，在2～8℃冰箱中可贮存7d。

1.3.5 磷标准贮备液100mg/L

准确称取经105℃烘干的磷酸二氢钾0.4394g溶于200mL水中，加入5mL硫酸，转入1000mL容量瓶中，加水定容，混匀。此贮备溶液可以长期保存。

1.3.6 磷标准工作液5mg/L

将磷标准储备溶液用浸提剂准确稀释20倍。此工作溶液不宜久存。

1.4 实验步骤

1.4.1 浸提步骤

称取2.5g通过风干研磨并过筛1mm的土样，置于干燥的150mL的具塞锥形瓶中，加入50mL浸提剂，再加一小勺无磷活性炭，塞紧，第一批置于恒温往复振荡器上，以25℃、160r/min震荡30min，第二批放入超声波清洗仪进行超声处理，整个超声过程中控制温度在（25±1）℃，按实验方法考察了5，10，15，20，25，30min对土壤中有效磷浓度的影响。

1.4.2 分离步骤

第一批立即用无磷滤纸过滤后所得滤液即为待测溶液，第二批倒入离心管中，利用可控温的冷冻离心机控制温度在（25±1）℃，考察了1000，2000，4000，6000，8000，10000，12000，14000rpm对土壤中有效磷浓度的影响，离心5min，取上清液，所得即为待测溶液。

1.4.3 钼锑抗分光光度法测定土壤有效磷

吸取10mL上清液和滤除液于干燥的50mL比色管中，加入5mL硫酸钼锑抗混合显色剂，慢慢摇动，使二氧化碳逸出。再加入10mL水，充分摇匀，逐尽二氧化碳。在室温高于15℃处放置30min后，用比色皿在700nm波长处，测读吸光度，以空白溶液（10mL浸提液代替土壤滤出液，同上处理）为参比液，调节分光光度计的零点。

1.4.4 标准曲线绘制

在土样测定的同时，吸取磷标准工作液0，1.5，2.5，5，10，15，20mL分别放入7个50mL容量瓶中，并用浸提剂定容，同上处理显色，测度系列溶液的吸光度，然会以上述标准系列溶液的磷浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。此标准系列中磷浓度依次为0，0.15，0.25，0.5，1，1.5，2.5mg/L。

2 结果和讨论

2.1 浸提时间选择

同一土壤样品在相同实验条件下采用不同时间进行超声浸提，考察了5，10，15，20，25，30min对土壤中有效磷浓度的影响，本实验采用3种不同的土样进行测定，浸提结果与国标法进行对比，结果如图1。从图1可以看出，随着超声时间的增大，一些难溶性的磷发生溶解，导致菜地、鱼塘和江边沙地有效磷的浓度一直增大。经与国标法对比可得，超声浸提10min得到的结果与国标法十分接近，如果超过10min，将会增加土壤中非有效磷成分的溶解，所以选择最合适的浸提时间为10min。与国标法的振荡浸提相比，超声浸提不仅缩短了浸提的时间，而且操作简单，大大提高了浸3提的速率。

图1 不同超声时间下测定有效磷浓度与国标法的对比

2.2 分离转速选择

对上面超声浸提的溶液进行离心分离，同一土壤样品相同离心时间内采用不同的离心转速进行分离，主要考察了1000，2000，4000，6000，8000，10000，12000，14000rpm对土壤中有效磷浓度的影响，分离结果与国标法进行对比，结果如图2。

图2 不同离心转速下测定有效磷浓度与国标的对比

从图2可以看出，采用不同的离心转速下测定有效磷浓度，有效磷的浓度变化幅度不大。因此，超声浸提是关键，离心是辅助。随着转速的不断增大，有部分吸附在土壤颗粒表面的磷粘在离心管底部，导致有效磷的浓度变小，当达到10000rpm左右时，有效磷的浓度变化趋于平稳，且与国标方法的结果最接近。因此，本实验选择最佳的离心转速为10000rpm。与国标法的无磷滤纸过滤相比，离心过滤大大节约了过滤时间，同时也节约了资源。

2.3 改进法与国标法测定土壤有效磷测试结果的相关性分析

分别对超声过滤与国标法、振荡浸提离心分析与国标法、超声浸提离心分离的改进法与国标法进行相关性分析，结果如图3。从图3可得，超声萃取改进法与国标法及离心分离改进法与国标法、改进法与国标法之间的相关性都呈极显著正相关，R2分别为0.99973，0.99944，0.99994。其中，改进国标法与国标法的R2最大，证明此改进方法具有可行性。

图3 改进法与国标法测定土壤有效磷测试结果的相关性分析

2.4 精密度实验

将3种土壤样品分别用国标法和改进法进行有效磷的测量，每种样品平行测定五次，测定结果对比见表1。从表1实验数据可以看出，菜地有效磷含量相对偏差小于5%，鱼塘和江边沙地的绝对误差小于1mg/kg，符合国标法的要求。因此，改进法测定土壤样品有效磷浓度的精密度是可靠的。

表1 改进法与国标法测定土壤有效磷结果对比

2.5 改进法与国标法测定土壤有效磷的方法条件比较

对改进法和国标法测定土壤有效磷的测定步骤进行了比较，进一步突出改进方法的可行性。结果如表2。

表2 国标法与改进法测定土壤有效磷的比较

3 结论与展望

对于测定土壤有效磷含量的GB 12297—1990《石灰性土壤有效磷测定方法》中浸提步骤和分离步骤进行了改进，即分别采用超声浸提代替振荡浸提，使用离心分离代替无磷滤纸过滤。改进方法与国标法相比，具有以下特点：

（1）采用改进法测定土壤样品中有效磷的含量时，对其精密度、准确度以及相关性进行了分析比较，其测定结果符合GB 12297—1990《石灰性土壤有效磷测定方法》的相关要求，精密度和准确度可靠。

（2）采用改进法与国标法得到的测试结果相关性分析都呈极显著正相关，R2达到0.99994。因此，其测定结果可靠。

（3）采用改进法测定土壤有效磷含量时，既省略了用无磷滤纸过滤环节而节省了滤纸用量，从而节约了测定成本，也大大缩短了浸提和过滤时间，并且可以一次性处理多个样品，提高了检测效率，为土壤有效磷的大批量检测提供了指导与借鉴。

国标法土壤有效磷测定过程中，要求将温度严格控制在25±1℃，而改进法在超声浸提和离心分离过程中，普遍存在升温现象，如何控制改进法实验过程中的温度，还有待进一步探索与研究。