病毒诱导基因沉默对叶用莴苣内源激素含量的影响

许梦男，郝新迪，陈 丽，韩莹琰

(农业应用新技术北京市重点实验室/植物生产国家级实验教学示范中心/北京农学院 植物科学技术学院，北京 102206)

叶用莴苣属菊科莴苣属，原产于欧洲地中海沿岸，为1～2年生的草本植物，口感清脆，食用方便，富含铁和镁等许多矿物质，并含有钾、钙、磷、硫等人体必需元素，营养保健价值高，受到广大消费者的青睐。叶用莴苣属于一类重要的叶类蔬菜，近年来也成为菊科植物基因组计划中被广泛研究的重要物种。

内源激素对植物有重要作用，是植物在特定环境信号诱导下通过自身代谢产生的小分子有机化合物。植物的一生都在受激素的调节，从种子萌发到开花结果再到衰老凋谢[1]。这些简单的小分子物质相互作用，产生复杂的生理生化效应，对植物的生长发育产生重要影响。生长素和赤霉素主要功能是促使细胞分裂分化，促进茎的伸长，有研究发现在水稻、拟南芥受到病原物侵染时，这两种激素可以起防御作用[2]。脱落酸又称应激激素，它可以使植物在受到外界不良刺激时诱导植物体内产生相关酶，提高自身抗性[3]。茉莉酸可以提高植物的防御能力，茉莉酸途径中COI1基因编码的F-box蛋白在植物防御反应中具有重要功能[4]。几种激素在植物体内可以单独行使功能，各激素的信号途径又可以相互交叉，形成一个复杂的调控网络，在植物体内发挥重要效应，使植物在受到一定的生物和非生物胁迫时，能够提高自身防御性和恢复能力。

病毒诱导的基因沉默技术，周期短，方法操作简单，该技术是用病毒携带目的基因侵染植物，使其表型和生理上出现变化，从而研究该基因在植物中行使的功能[5]。最早被用来描述植物受病毒侵染后症状的恢复情况，现已有效运用于鉴定植物对胁迫做出的应答反应[6,7]。植物在受到病毒侵染后会将病毒的mRNA降解掉，出现一定程度的抗性，形成一种保护自身稳定的机制，现在广泛应用的是TRV病毒载体，成功的应用于辣椒、马铃薯、烟草等植物上[8,9]。

ZFP锌指蛋白是一种具有指状结构并且需要与Zn2+结合的转录因子，在植物中被广泛研究，该蛋白主要参与植物的形态建成、生长发育，抵抗非生物胁迫及激素响应，除此之外，ZFP锌指蛋白在植物受到生物胁迫后也会做出防御反应，对促进植物的生命进程有重要影响[10,11]，本试验利用VIGS技术侵染叶用莴苣，诱导LsZFP1沉默后，测定叶用莴苣内源激素含量，分析经TRV介导侵染后，各处理叶用莴苣内源激素含量有何变化，为进一步探究LsZFP1在叶用莴苣中行使的功能提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

叶用莴苣品种‘PS-11’由北京开心格林科技有限公司提供，种植于北京农学院计算机温室。选取干净无杂质的种子进行催芽处理，播种于50孔穴盘，幼苗长至4叶1心时，单棵定植在营养钵中，缓苗7 d后，进行TRV病毒侵染。试验处理为：携带LsZFP1基因的病毒载体(TRV-LsZFP1)，空载(TRV)，空白对照(WT)。

1.2 方 法

1.2.1 侵染叶用莴苣 将配置好的侵染液用不带针头的注射器注入叶片背面，直至有明显水渍状，每个处理注射30株，每株注射2片叶子，每片叶子以叶脉为中心注射两处。注射21 d后，取其功能叶片和茎，速冻于液氮后，-80 ℃保存，每个处理3次重复。

1.2.2 鉴定侵染植株 用TRV特异性引物(TRV-F：5′-GCTTTATTATTACGGACGAGTGG-3′； TRV-R：5′-GAACCTAAAACTTCAGACACGGAT-3′)检测处理植株。

1.2.3 内源激素测定 酶联免疫法测定四种激素含量，选用ELISA试剂盒。称0.7 g样品于研钵中，研钵提前冰浴，后续研磨也一直处于冰浴状态，加入2 mL 提取液将样品磨碎，转入离心管中，再用提取液冲洗研钵一并转入管中，4 ℃下提取6 h，4 000 r/min离心15 min，取上清液并记录体积。上清液过固相萃取柱后转入离心管中，吹干，用样品稀释液定容至2 mL，490 nm波长，上酶联免疫仪(BIO-RAD Mode 550)读数[12]。

采用Excel 2019处理数据，使用SPSS软件进行显著性分析，用Origin软件作图。

2 结果与分析

2.1 检测鉴定结果

如图1所示，TRV出现200 bp左右的条带，侵染植株TRV-LsZFP1出现400 bp左右条带，空白处理无条带，结果表明，TRV病毒成功侵染到植株中。

2.2 侵染后叶用莴苣脱落酸含量变化

脱落酸作为应激激素，在植物受到不良刺激后含量会迅速上升，提高自身抗性。图2可以看出，TRV-LsZFP1侵染植株茎、叶中脱落酸含量都很高，均到400 μg/L以上；空白处理的植株中，茎、叶脱落酸含量是TRV-LsZFP1侵染植株的65%，显著降低，可以看出脱落酸含量受LsZFP1基因表达的影响。TRV侵染植株中脱落酸含量在320 μg/L左右，2个处理脱落酸含量都显著高于空白对照。

2.3 侵染后叶用莴苣生长素含量变化

图2可以看出，TRV-LsZFP1和TRV侵染的植株茎、叶中生长素含量高，均达到100 μg/L左右，空白处理的植株中，茎、叶生长素含量是75 μg/L左右，和侵染植株相比显著降低40%左右。

2.4 侵染后叶用莴苣茉莉酸含量变化

茉莉酸主要参与植物的生长发育和免疫反应，可以从多方面增强植物对细菌、病毒的抗性。图2可以看出，每个处理叶中茉莉酸含量要高于茎中茉莉酸含量。TRV-LsZFP1侵染植株叶中茉莉酸含量显著高于空白对照，其含量为1 311.92 μg/L，与TRV处理相比提高18%，相比空白对照提高38%。TRV-LsZFP1侵染植株和TRV茎中茉莉酸含量达到1 200 μg/L左右，显著高于对照组32%。

2.5 侵染后叶用莴苣赤霉素含量变化

赤霉素会促进植物茎的伸长，当赤霉素合成受到抑制时，叶用莴苣茎伸长时间(抽薹)会延后，有利于对叶用莴苣抗抽薹方面的研究。图2可以看出，TRV-LsZFP1侵染植株与其他两个处理差异是显著的。总体来看，TRV-LsZFP1侵染的植株中赤霉素含量最低，茎中赤霉素含量为498.26μg/L，叶中含量为460.39 μg/L；TRV侵染的植株和空白对照茎、叶中赤霉素含量相近，为590 μg/L左右， TRV-LsZFP1侵染植株与两者相比，下降了21.6%。

3 讨 论

植物在受到生物和非生物胁迫时，为了维持自身正常的生理机能，会启动自身防御网络，该网络是由复杂的信号转导途径组成的一套防御系统，植物体内各种激素相互作用形成的生理效应就是此防御系统的重要组成部分[13,14]。许多研究表明，茉莉酸、脱落酸在植物受到病原体侵染过程中会发挥重要功能，积极防御病原体对植物产生的不良反应[15]。茉莉酸主要是通过调节茉莉酸途径中的转录因子，受体复合物和相关茉莉酸合成基因组成的信号转导网络来抵抗病原体对植物体造成的危害[16]。植物受侵染出现伤口后，细胞膜会发生电位变化，加速茉莉酸的合成[17]。脱落酸参与植物胁迫反应，通过诱导与抗性有关酶的合成而提高植物在不良环境中的适应能力。脱落酸也会促进茉莉酸信号路径的分支反应，当死体营养性病原物侵染拟南芥时，茉莉酸受脱落酸影响，在拟南芥中的含量水平会升高，使拟南芥增强对病原体的抗性[18]。本试验中，将TRV病毒载体注射侵染叶用莴苣后，侵染植株脱落酸和茉莉酸含量较对照植株会显著升高，表明叶用莴苣受到病毒注射伤害后，为了抵抗胁迫，会做出应激反应，调控内源激素含量发生变化，来增加自身抗性。ZFP锌指蛋白也是植物抵抗胁迫过程中的重要组成部分[19]，本试验中，LsZFP1转入TRV病毒载体后侵染叶用莴苣，TRV-LsZFP1植株赤霉素显著低于其他两组对照，而TRV处理组与空白对照组无明显差异，赤霉素含量下降可能是由于TRV-LsZFP1经农杆转导侵染叶用莴苣后，LsZFP1表达受到抑制，而在某种通路中促进DELLA蛋白合成，使赤霉素信号转导受到阻碍导致含量降低。另外一种可能是叶用莴苣受到病毒侵染后，与赤霉素合成相关的反馈调节的敏感性降低，具体机制还需进一步研究[3]。当赤霉素途径受到抑制时，赤霉素合成含量降低，有另外一点优势是可以延长叶用莴苣茎伸长的时间，这有助于对叶用莴苣抽薹作用的研究。生长素也能有效参与植物抵抗胁迫的过程，在本试验中，TRV-LsZFP1和TRV侵染植株生长素含量较空白对照植株显著增加，我们推测当叶用莴苣受到TRV病毒侵染后，影响生长素合成的相关通路，使生长素含量在植物受到病毒侵染后显著增加，促进侵染伤口尽快恢复[20]。植物体内各种激素信号转导途径，组成了植物防御反应的复杂调控网络，具体作用机制有待进一步研究。