基于转录组信息的叶用莴苣MADS-box转录因子家族分析

郝新迪，许梦男，董波波，陈 丽，刘超杰，范双喜，韩莹琰

(北京农学院 植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206)

叶用莴苣(LactucasativaL.)，俗称生菜，是北京地区种植面积最大的叶类蔬菜，其性喜冷凉气候，夏季高温造成“先期抽薹”，严重影响食用品质和商品价值[1,2]。抽薹开花是植物从营养生长向生殖生长转变的关键环节，称为成花转变。植物成花转变时间受到复杂的遗传调控网络的严格控制，到目前为止，在模式植物拟南芥中，已经确定了春化途径、自主途径、环境温度途径、赤霉素途径、光周期途径、年龄途径和糖途径等7条控制开花的遗传途径[3,4]，这7条途径彼此独立又相互交织，它们激活了一套开花途径整合子基因[包括MADS-box家族基因SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS(SOC1)和AGAMOUS-LIKE24(AGL24)]，进而激活花分生组织特征基因[包含MADS-box家族基因APETALA1(AP1)，CAULIFLOWER(CAL)和FRUITFULL(FUL)]，最终启动拟南芥开花[4-6]。在拟南芥光诱导开花途径中，CONSTANS(CO)在拟南芥韧皮部伴细胞中表达并激活FT在叶片维管组织中表达，随后FT转运至顶端分生组织中激活FUL和SOC1在茎顶端分生组织中表达，从而开启花发育[7,8]。此外，春化途径通过抑制MADS-box基因FLOWERINGLOCUSC(FLC)表达来激活开花[3]。与拟南芥、大白菜、甘蓝、萝卜等“低温春化”型蔬菜不同，叶用莴苣从种子发芽到花芽分化前的高温环境关系到其花芽形成从而影响抽薹，气温越高抽薹越早[9]。前期研究发现赤霉素调节叶用莴苣的抽薹，但也许是MADS-box基因，而不是赤霉素，在表现不同抽薹效果中起到重要作用[10]。

目前，关于叶用莴苣MADS-box基因的研究鲜有报道。前期课题组研究过程中在叶用莴苣基因组中共鉴定了82个MADS-box家族基因[11]，后续利用2个具有高温抽薹性差异的品种：耐抽薹品种‘S24’和易抽薹品种‘S39’进行转录组分析，发现9个促进开花的MADS-box家族基因被特异性诱导[10]。对高温和常温下生长的品种‘S39’进行转录组学分析，发现5个MADS-box基因差异表达[12]。

本研究对叶用莴苣中上述14个MADS-box家族转录因子进行鉴定分析，以叶用莴苣品种‘S39’为试验材料，采用qRT-PCR技术检测在高温处理下14个MADS-box家族基因的表达模式，筛选在叶用莴苣高温抽薹过程中发挥重要作用的MADS-box家族基因。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

以叶用莴苣早抽薹品种‘S39’为试验材料。将种子催芽24 h 后播种于50孔穴盘(草炭∶珍珠岩∶蛭石=3∶2∶1)中，在人工气候室中生长，1周后定植于直径10 cm营养钵中：白天25 ℃，夜晚15 ℃，光照强度12000 lx，光照时间16 h/d，相对湿度为60%；，植株生长至5叶1心时进行高温处理：白天35 ℃，夜晚25 ℃，其余条件不变。高温处理1 d，3 d，5 d，7 d，9 d，11 d，13 d，15 d后分别随机选取3株长势一致的幼苗，取其第4片真叶，液氮速冻后-80 ℃保存。

1.2 试验方法

1.2.1 叶用莴苣MADS-box家族转录因子的筛选和理化性质分析 基于实验室已有的转录组测序数据[10,11]，筛选到14个差异表达的MADS-box家族转录因子，利用DNAMAN将14个MADS-box转录因子序列比对到此前课题组鉴定的82个MADS-box转录因子序列中[9]，采用ExPASy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在线工具预测叶用莴苣MADS-box蛋白理化性质，采用在线网站 Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi)预测亚细胞定位。

1.2.2 样品总RNA提取和反转录 叶用莴苣总RNA提取参照快速通用植物RNA提取试剂盒(北京兴华越洋生物科技有限公司)说明书。利用Thermo NanoDrop2000紫外分光光度计检测 RNA样品浓度；用1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 质量。总RNA反转录参照TransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)说明书。

1.2.3 qRT-PCR 以高温处理1 d，3 d，5 d，7 d，9 d，11 d，13 d，15 d后叶用莴苣‘S39’叶片cDNA为模板，利用Primer 5.0 设计引物(表1)，以叶用莴苣18SribosomalRNA(HMO047292.1)为内参基因(表1)。使用 TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒(北京宝日医生物技术有限公司)进行qRT-PCR反应。反应体系10 μL，包括5 μL TB Green®Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)，2 μL ddH2O，1 μL cDNA模板，上、下游引物各1 μL。反应程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，共39个循环。反应在Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪上进行。每个样本设置3次重复。采用2-△△Ct法计算基因的相对表达量。

表1 引物序列Tab.1 Primers for sequences

2 结果与分析

2.1 相关MADS-box基因的筛选和理化性质分析

根据实验室前期转录组数据分析，对MADS-box相关基因功能和亚细胞定位进行预测，发现9个MADS-box基因在‘S24’和‘S39’中差异表达(表2)，5个MADS-box基因在常温和高温处理下的‘S39’中差异表达(表3)。

表2 ‘S39’中9个上调的MADS-box基因[10]Tab.2 List of 9 MADS-box genes that were significantly up-regulated in lettuce line ‘S39’

表3 高温下‘S39’茎尖中5个上调的MADS-box基因[12]

利用ExPASy protparam tool对14个叶用莴苣MADS-box蛋白进行理化性质分析，由表4可知，14个MADS-box编码蛋白的氨基酸数量为212(LsMADS39和LsMADS45)～253(LsMADS14)个，理论等电点范围为5.27(LsMADS39)～9.44(LsMADS32)，表明不同的MADS-box家族蛋白质在不同的微环境中发挥的功能存在差异。除LsMADS16和LsMADS39为稳定蛋白外，其余均属于不稳定蛋白(不稳定系数小于40为稳定蛋白)。14个MAD-box蛋白的脂肪系数为71.36(LsMADS48)～92.88(LsMADS39)，均小于100，平均亲水性均小于0，为亲水性蛋白。通过在线软件Cell-PLoc 2.0对14个MADS-box基因家族成员的氨基酸序列进行亚细胞定位预测，结果显示14个MADS-box家族蛋白均定位于细胞核内。

表4 14个叶用莴苣MADS-box基因理化性质分析Tab.4 Analysis of physicochemical properties of 14 MADS-box genesin lettuce

2.2 对MADS-box相关基因进行qRT-PCR分析

在叶用莴苣‘S39’中不同时间高温处理下，MADS-box相关基因表达量如图1所示，LsMADS32表达量无显著规律；LsMADS16和LsMADS37表达总体呈下降趋势；LsMADS5，LsMADS14，LsMADS15，LsMADS29，LsMADS35，LsMADS39，LsMADS43，LsMADS45，LsMADS48，LsMADS54和LsMADS56表达趋势基本相同，呈先上升后下降趋势，LsMADS15在高温处理7 d后达到峰值，其他基因在高温处理5 d后达到峰值，其中LsMADS54在高温处理5 d后骤升1 000倍，LsMADS56在高温处理5 d后骤升70倍。

3 讨 论

MADS-box是一类重要的转录因子，在植物根[13]和叶片[14]发育、果实发育[15]和成熟[16,17]、开花和花发育[11]等生长发育过程和逆境胁迫[18]中发挥着重要作用。前期课题组研究发现，在易抽薹品种‘S39’中9个MADS-box相关基因能够明显的诱导开花，这表明MADS-box基因在表现不同抽薹效果中可能起到重要作用[10]。

本研究通过对叶用莴苣转录组数据进行挖掘，共鉴定出14个与高温促进抽薹相关的MADS-box家族转录因子。理化性质研究结果表明，不同MADS-box蛋白的理化性质存在一定差异，说明其发挥的生物学功能也不相同。亚细胞定位预测结果显示14个MADS-box蛋白均定位于细胞核，这符合其作为转录因子的特征，可能通过调控细胞核基因的转录来发挥其功能[19]。

本研究通过对14个叶用莴苣中MADS-box相关基因在高温处理下的表达量分析得出：LsMADS32表达量无显著规律，推测其与叶用莴苣高温抽薹无关；LsMADS16和LsMADS37表达总体呈下降趋势，推测其对叶用莴苣高温抽薹具有负调控作用；LsMADS5，LsMADS14，LsMADS15，LsMADS29，LsMADS35，LsMADS39，LsMADS43，LsMADS45，LsMADS48，LsMADS54和LsMADS56表达呈先上升后下降趋势，LsMADS15在高温处理7 d后达到峰值，其他基因在高温处理5 d后达到峰值，其响应高温胁迫的表达模式与‘S39’在高温处理后7 d左右顶端分生组织呈拱形状，随后发生从营养生长向生殖生长转变的细胞学观察结果一致[12,20]。LsMADS54在高温处理5 d后骤升1 000倍，LsMADS56在高温处理5 d后骤升70倍，推测其为叶用莴苣响应高温诱导后抽薹开花调控网络中的关键基因。

综上所述，本研究分析了高温处理下14个叶用莴苣高温促进抽薹的相关MADS-box基因的表达模式，发现LsMADS54和LsMADS56可能在叶用莴苣响应高温诱导后抽薹开花中起关键作用，但其作用机制还有待进一步研究。