基于氮化碳制备及其生物荧光成像性能研究

陈孟雅，郑璐璐，杨 翠

（1.上海理工大学 环境与建筑学院，上海 200093；2.上海理工大学 光电信息与计算机工程学院，上海 200093；3.上海市杨浦区大桥社区卫生服务中心，上海 200090）

引言

近年来，生物成像技术已在疾病诊断方面，尤其是心血管疾病患者血管成像方面展现出较大的应用潜力，成为生物医学应用中一种有前途的检测分析和疾病诊断技术，荧光成像、磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）和多模式成像等多种生物成像技术也越来越受到关注[1-3]。生物成像应用需求的不断增长也大大促进了各种功能纳米材料的合理设计和制造，以荧光纳米粒子为探针的生物荧光成像技术，将先进的纳米材料与生物成像应用相结合，产生了新型生物成像诊疗平台。目前，金属纳米团簇[4]、纳米尺度金属−有机框架[5]、量子点[6]和纳米片[7]等多种有机或无机荧光材料也被广泛应用于生物血管成像领域。Wang 等[8]以带正电荷的多肽作为表面配体合成荧光的金纳米团簇，能够靶向对细胞核染色。Wang 等[9]以发光介孔镧系金属有机框架特有的空间结构为基础，水热法制备双模发光多功能纳米载体NaLnF4@MOF-Ln 纳米复合材料用于药物传递和细胞成像。Zheng 等[10]制备钆掺杂碳量子点作为双模成像探针，用于增强磁共振成像和荧光成像。然而，重金属材料的毒性限制其在体内和体外的应用，生物成像越来越希望寻求更安全高效的荧光材料。从2004 年起，Xu 等[11]从碳纳米管中提取出了荧光碳纳米颗粒，这一发现使得非金属荧光材料逐渐被人们所关注，其中荧光碳基材料具有优异的光学吸收率、化学稳定性、生物相容性和低毒性等优点而受到越来越多的关注[12]。本文对石墨相氮化碳进行剥离以得到石墨相氮化碳纳米片，并进一步研究了石墨相氮化碳纳米片的荧光特性，同时显示了其良好的细胞荧光成像效果，在生物传感器和成像技术等领域具有广泛的应用前景。

1 石墨相氮化碳的特性

氮化碳（C3N4）是一种低成本且富含碳、氮元素的材料，其中石墨相氮化碳（g-C3N4）是在常温常压条件下最稳定的存在形式[13]。在石墨相氮化碳中，C、N 原子以sp2形式杂化并连接形成类苯环的共轭六元环结构，再相互连接铺展延伸形成2D 层堆积构成类石墨结构，图1 所示，为三均三嗪环的结构单元。2009 年，Wang等[14]发表了关于类石墨相C3N4在可见光下分解水制氢的研究工作之后，g-C3N4引起世界范围内研究人员的高度关注。氮化碳纳米材料作为一种新兴的材料类别，由于具有独特的发光性质，且不含有毒金属元素，稳定性好，量子产率高以及出色的生物相容性等优点，已被作为荧光探针广泛用于生物传感领域，如重金属离子检测及生物分子的检测[15]。此外，作为一种新型的无金属聚合半导体，g-C3N4具有可控制的成分、尺寸、厚度、孔结构、尺寸分布和形态。因此，通过适当的改性来开发g-C3N4材料具有广泛的应用价值，使其在荧光传感、生物成像等领域具有广泛的应用前景[16-18]。

图1 石墨相氮化碳的晶体结构Fig.1 Crystal structure of graphitic carbon nitride

2 实验部分

2.1 试剂和仪器

本文中，若化学药品无另外说明均为分析纯。三聚氰胺购于国药控股化学试剂有限公司，次氯酸钠购于阿拉丁公司。磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）RPMI 1640 培养基、胎牛血清（FBS）购于赛默飞公司，CCK-8 试剂盒购自碧云天公司。

使用的仪器主要有Bruker D8 Advance X 射线衍射仪（德国），Hitachi-S4800 扫描电子显微镜（日本），Hitachi F-4600 荧光分光光度计（日本），Tecan Spark 多功能酶标仪（瑞士），Shimadzu UV-2600 紫外-可见漫反射光谱仪（日本），Carl Zeiss LSM 900 激光共聚焦显微镜（德国）。

2.2 石墨相氮化碳的制备

近年来，热解法[19]是氮化碳制备最常用的方法，是利用含C、N 元素的有机前驱体在高温下发生缩聚反应，其优势在于反应条件简单且产率高。由于氮化碳原产物材料分散性较差，不宜应用在生物医学领域。为了更好地提高氮化碳的生物利用率，需对其进行改性修饰。化学剥离法利用氧化还原能力来削弱层间的范德华力，可以得到易分散的纳米片，该法耗时较短且产率较高[20]。制备步骤如下。

1）g-C3N4的制备。以三聚氰胺（12 g）为有机前驱体，于马弗炉程序升温（5 ℃/min）至550 ℃并保持550 ℃反应4 h，得到淡黄色固体g-C3N4。

2）P/g-C3N4的制备。将上述g-C3N4（1 g）在200 mL 的次氯酸钠溶液（1 mol/L）中进行快速磁搅拌5 h。然后，通过离心收集沉淀，用去离子水洗涤3 次，80 ℃真空干燥过夜，得到黄色粉末状剥离态g-C3N4（记作P/g-C3N4）。

2.3 细胞实验

小鼠乳腺癌（4T1）细胞、人支气管上皮样（HBE）细胞用RPMI 1640 培养基，于37 ℃、含5% CO2的细胞恒温箱培养。将HBE 细胞接种在96 孔板中培养24 h 后，与由0.22 μm膜过滤的g-C3N4或P/g-C3N4以不同质量浓度（0，10，50，100，200，300 μg·mL−1）再孵育24 h，使用CCK-8 法试剂盒对细胞进行处理，用酶标仪检测细胞相对存活率。

为观察P/g-C3N4的细胞成像情况，选择4T1 细胞铺于共聚焦培养皿，待细胞贴壁后，以PBS 冲洗数次，加入200 μg·mL−1P/g-C3N4，在37 ℃下孵育12 h，用PBS（1 mL）洗涤数次，然后使用激光共聚焦显微镜激发波长为358 nm通道，获得4T1 与P/g-C3N4孵育后的共聚焦荧光显微镜图像。

3 结果与讨论

3.1 表征分析

一般来说，由于g-C3N4在水溶液中容易聚集，其分散性较差。因此，制备了g-C3N4分散相，并对其分散性能进行了验证。所制备材料g-C3N4和P/g-C3N4粉末相和分散相中的典型形貌如图2 所示，g-C3N4和P/g-C3N4粉末都是疏松的黄色粉末。由图2（b）可以看出，g-C3N4容易沉积而P/g-C3N4在溶液中的分散性能较好。此外，200 mg·L−1样品分散液的丁达尔效应进一步揭示了其分散溶液的稳定状态（见图2（c））。这表明P/g-C3N4在水中具有良好的分散性和稳定性。

图2 制备材料在粉末相和分散相中的典型形貌Fig.2 The typical appearances of the as-developed materials in the powder phase and dispersion phase

样品的X 射线衍射（XRD）能谱如图3（a）所示，其中g-C3N4的XRD 能谱图在2θ=27.4°处出现的最强峰归属于芳香族体系的层间堆积特征，（002）面；13.0°处的衍射峰表示平面内的结构堆积，（100）面[21]。P/g-C3N4中的这两个峰均有明显减弱，这表明在剥离的过程中，P/g-C3N4的层状堆积结构与g-C3N4相比减少，形成较薄纳米片结构。从图3（b）紫外−可见漫反射光谱中可以看出，样品P/g-C3N4相较于g-C3N4在波长大于420 nm 的可见光吸收都有较为明显的增强，可能是P/g-C3N4层状剥离不仅提高了其比表面积，增强了光吸收能力，使其具有较高的光催化性能。

图3 石墨相氮化碳的晶体结构和光学性质Fig.3 Crystal structure and optical properties of graphitic carbon nitride

为了进一步确认P/g-C3N4剥离处理效果，使用扫描电子显微镜进行观察材料表面形貌特征，如图4 所示。由扫描电子显微镜(SEM)图像观察到，相比于g-C3N4，P/g-C3N4呈现很多不规则排列的片状堆积结构，这与XRD 分析结果吻合的很好。由此可见，P/g-C3N4材料表面形貌已被剥离成片状。

图4 制备材料的SEM 图Fig.4 The SEM pictures of the as-developed materials

3.2 石墨相氮化碳的荧光特性

石墨相氮化碳相应的荧光发光机理为：在受到光激发时，处于π 轨道基态的电子会跃迁至π*轨道激发态，并在价带留下空穴，之后电子空穴对复合时辐射的荧光可以用于生物成像、荧光传感等领域。从图5 荧光光谱图中可以看出，g-C3N4和P/g-C3N4的荧光发光的波长范围是400～560 nm，荧光最强峰位于435 nm 左右。由于对P/g-C3N4的片层剥离，导致其纳米尺寸变小，并且荧光发射峰发生些许蓝移。

图5 石墨相氮化碳荧光光谱Fig.5 Fluorescence spectra of graphitic carbon nitride

3.3 细胞毒性和细胞成像实验

优异的生物安全性是荧光染料应用于生物成像必不可少的条件。图6 是P/g-C3N4作用4T1 细胞24 h 后的细胞存活率图。当P/g-C3N4的质量浓度达到300 ug·mL−1时，细胞存活率仍在95%以上，表明P/g-C3N4具有较低的生物毒性，因此所制备的P/g-C3N4可成功用于生物领域研究。

图6 不同质量浓度P/g-C3N4对HBE 细胞毒性Fig.6 Cytotoxicity of HBE cells co-incubated with different concentrations of P/g-C3N4

由于P/g-C3N4具有优异的荧光性能和较低的生物毒性，将P/g-C3N4用于细胞内生物成像，并通过共聚焦显微镜观察其生物成像能力。图7 为4T1 细胞和P/g-C3N4培养的荧光共聚焦图像。从图中可以看出，4T1 细胞的形态在明场图中清晰可见（见图7(a)）。当用紫外光激发时，P/g-C3N4孵育的4T1 细胞在暗场图中显示出较强程度的蓝色荧光（见图7(b)）。在叠加图中可以更清楚地看到P/g-C3N4很容易渗透到细胞中，但没有穿透细胞核，细胞、细胞核和细胞质之间有清晰边界（见图7(c)）。这些结果表明P/g-C3N4 有用于高对比度生物成像的潜力。

图7 细胞共聚焦荧光成像Fig.7 Confocal fluorescence images of cells

4 结论

简单高效地构建了具有良好的水溶性、荧光性和良好的生物相容性的材料P/g-C3N4，制备过程简单、成本低、稳定性高，可用于细胞的荧光成像。通过材料分散液实验，验证了该材料在水中具有良好的分散性和稳定性，通过SEM观察，验证P/g-C3N4材料已被剥离成片状，同XRD 分析结果保持一致。紫外–可见漫反射光谱和荧光光谱实验表明P/g-C3N4材料在蓝绿光发光波段吸收峰明显增强，荧光最强峰位于435 nm 左右，增强了材料的光催化性能。基于激光共聚焦的细胞实验进一步验证了改性后的纳米材料能够被细胞吞噬，在紫外光358 nm 激发下显示出较强程度的蓝色荧光，其独特的荧光和生物特性在生物成像尤其是血管成像等方面有着广泛的应用前景。高催化性能的材料可以携带心血管类治疗药物，通过改性后材料的光催化性能增强药物的治疗效果，在为心血管病人构建基于血管成像及治疗的诊疗一体化平台上具有良好的潜能。