一株益生性植物乳杆菌的体外安全性评价

关仁梅 罗强 生龙纳雍 马倩宁 罗璠

牦牛酸乳是青藏高原地区的人们经常食用的乳制品，只有了解该地区优势乳酸菌的安全性，才能更好的对其进行开发利用。本试验所采用的植物乳杆菌11是分离自西藏地区的自然发酵牦牛乳，前期经本实验室测定益生性良好，现通过体外安全评价来评定其安全性，包括溶血试验、明胶液化试验、有害代谢产物测定和耐药性评价试验，旨在为其作为益生菌应用提供依据。

一、材料与方法

1.材料。实验菌株是植物乳杆菌11（Lactobacillus plantarum），质控菌株大肠杆菌ATCC8099、金黄色葡萄球菌ATCC25923购自中国科学院微生物研究所。

2.方法。（1）溶血试验。菌种活化后划线接种于哥伦比亚血平板上，30℃恒温倒置培养48h，观察记录菌落周围的变化情况，以具有溶血性质的金黄色葡萄球菌ATCC25923作为阳性对照。

（2）明胶液化试验。将活化后的菌株穿刺接种于5mL明胶培养基中，30℃恒温培养48h后，置于4℃条件下，使培养基完全凝固。将生理盐水穿刺于明胶培养基中，作为阴性对照。

（3）有害代谢产物试验。一是氨基酸脱羧酶检测。菌种活化后分别在添加了前体氨基酸的氨基脱羧酶筛选培养基和未添加前体氨基酸的培养基划线，30℃恒温培养24h和48h，观察培养基的颜色变化。二是偶氮还原酶的测定。将活化后的实验菌株涂布于含有直接蓝71的琼脂培养基上（5mg/L），30℃恒温培养72h，观察是否有水解圈产生。三是吲哚实验。以1%接种量将活化后的实验菌株接种于蛋白胨水培养基中，30℃恒温培养48h，加入吲哚试剂观察颜色变化。以大肠杆菌ATCC8099为阳性对照菌株，以蛋白胨水培养基为空白对照。

（4）耐药性评价。药敏试验按照美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory StandardsInstitute，CLSI）2020-M100所指导的Kirby-Bauer纸片扩散法进行试验，以CLSI 2020-M100第30版公布的数据作为标准，判定该药物对肠球菌是耐药（R）、中介（I）或是敏感（S）。

（5）数据处理与分析。试验均重复3次，数据以均值±标准差表示，采用Excel 2010和SPSS20.0进行数据分析。

二、结果与分析

1.溶血试验结果。如图1所示，阳性对照金黄色葡萄球菌菌落周围出现了透明圈，发生了β-溶血;实验菌株周围无溶血环出现，为γ-溶血，即不溶血。

2.明胶液化试验结果。实验菌株没有使明胶固体培养基表面发生液化，表现为阴性。

3.有毒代谢产物试验结果。第一，实验菌株在空白实验和添加L-酪氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸和L-鸟氨酸的平板颜色均未改变，为阴性结果，表明实验菌株并不产生测定的这4种生物胺。第二，实验菌株也不产生偶氮还原酶。第三，如图2所示，大肠杆菌ATCC8099发酵液液面出现玫瑰红色，为阳性结果;实验菌株的发酵液液面颜色无变化，为阴性结果，表明实验菌株不会代谢产生色氨酸酶而分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。

4.耐药性评价。本实验采用药敏纸片法检测了7种临床常用抗生素的药物敏感性，表1展示了实验菌株对不同抗生素的耐药情况，对红霉素、阿奇霉素和四环素表现出敏感性，对链霉素、卡那霉素、诺氟沙星表现出明显的抗药性。

三、结论与讨论

乳酸菌或有潜在的安全性问题，因此需确定菌株的耐药性等问题。研究发现，大多数革兰氏阳性菌对阿奇霉素、红霉素类药物敏感，链霉素与青霉素使用广泛，耐药问题非常普遍，本试验结果与相关报道一致。乳酸菌的抗性主要是固有和获得性，若菌株具有获得性抗体，则具有将毒力基因转移到肠道中的风险，因此后续需要检测实验菌株对抗生素的抗性是否具有转移性。在本研究中，实验菌株无溶血现象，不融化明胶，没有产生有毒代谢产物，这与目前一些对植物乳杆菌的研究一致。

本研究通過对植物乳杆菌11进行的体外安全性评价发现，实验菌株有害代谢产物测定均为阴性，不溶血，不溶解明胶，对阿奇霉素、红霉素和四环素敏感，对青霉素、诺氟沙星、链霉素、卡那霉素具有不同程度的耐药性。综合试验结果可以初步判断，植物乳杆菌11是一株安全的益生性菌株，这为植物乳杆菌11进一步的开发与应用提供了理论基础。

作者简介：关仁梅（1996-），女，汉族，安徽淮北人，硕士研究生，研究方向为食品微生物学。