Saa3缺失改善阿尔茨海默病模型小鼠认知功能障碍和Tau蛋白病理进展

陈岩青，宫 平，刘 震，张 岩，于 洋

（上海交通大学药学院，上海 200240）

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一种进行性发展的中枢神经系统退行性疾病。临床主要表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力逐渐减退，并伴随各种精神症状［1-2］。近年来，越来越多的研究表明，神经炎症反应参与AD的整个病理进程［3］。血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A，SAA）是一种高敏感的急性时相反应蛋白，与多种慢性炎症疾病相关［4］。有研究报道AD患者脑内及脑脊液中SAA的表达较正常人有明显增加［5-6］。并且，免疫组织化学检测发现，AD患者脑内SAA与Aβ斑块共定位［7］。本课题组最新研究发现，SAA能够通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路抑制星形胶质细胞向Aβ斑块的迁移和募集［8］。这些结果提示，SAA可能参与AD的病理进程。在小鼠中，SAA由3个诱导型基因Saa1、Saa2和Saa3以及组成型表达的Saa4组成的家族编码。它们的主要合成部位是肝脏，而在机体受到相应刺激时，Saa3可以在肝外组织中表达，是在肝外诱导表达的主要亚型［9-10］。本课题组前期研究结果表明，外周给予脂多糖（LPS）能够诱导小鼠脑内神经细胞内Saa1、Saa2和Saa3表达升高，而Saa3的诱导表达量远远高于Saa1和Saa2［11］。因此，本研究采用Saa3基因敲除小鼠（Saa3-/-）建立了Saa3缺失的APP/PS1转基因AD小鼠模型和侧脑室内（ICV）注射链脲佐菌素（STZ）AD小鼠模型，探究Saa3在AD小鼠脑内的表达以及对AD小鼠认知功能、非认知功能和tau蛋白病理进程的影响，以期为AD的预防及治疗提供新的靶标。

1 材料

1.1 试 剂

链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）；Saa3多克隆抗体（武汉ABclonal公司）；Alexa Fluor®488抗兔IgG荧光二抗（美国Life Technology公司）；DAPI染色剂（碧云天生物技术公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（美国Thermo Fisher公司）；小鼠抗总tau（Tau5）和 兔 抗 磷 酸 化tau pSer199、pThr205、pSer396和pSer404抗体（美国Invitrogen公司）；小鼠抗3-磷酸甘油醛-磷酸脱氢酶（GAPDH）和兔抗β-Actin抗体（北京生物合成生物技术有限公司）；荧光二抗IRDye®800CW和IMDye®800CW（美国LI-COR公司）；其他试剂购自美国Sigma公司。

1.2 仪 器

68000 脑立体定位仪（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；动物专用电子称（上海蒲春计量仪器有限公司）；小鼠转棒式疲劳仪、旷场实验箱、高架十字迷宫、Morris水迷宫（上海移数信息科技有限公司）；CM 1900 UV冷冻切片机、TCS SP8激光共聚焦成像系统（德国Leica公司）；IKA-T10匀浆机（德国IKA公司）；多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；蛋白免疫印迹电泳系统（美国Bio-Rad公司）；多功能PCR仪（美国Thermo Fisher公司）；Odyssey P140-CLx红外荧光扫描成像系统（美国LI-COR公司）。

1.3 动 物

C57BL/6遗传背景的Saa3-/-（Saa3基因敲除）小鼠购自基因敲除小鼠计划（KOMP）信息库（Davis，CA），C57BL/6遗传背景的APP/PS1转基因小鼠（APPSWE/PS1ΔE9+/-，库存编号005864）购自Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）。实验开展期间，实验小鼠委托上海交通大学动物实验中心协助饲养管理，小鼠饲养环境均为SPF级（无特定病原体）。饲养的小鼠（每笼3~5只小鼠）光照/黑暗周期为12 h/12 h，可随意获取食物和水。饲养、繁殖和动物实验均符合美国国家卫生研究院《实验动物的护理和使用指南》，并经上海交通大学生物研究伦理委员会批准。

2 方法

2.1 AD模型小鼠的构建及分组

2.1.1APP/PS1转基因AD小鼠模型构建及分组 将Saa3-/-小鼠与APP/PS1小鼠杂交得到APP/PS1+/--Saa3+/-小鼠，然后将APP/PS1+/--Saa3+/-小鼠雌雄交配以得到以下4种基因型小鼠：WT（APP/PS1-/--Saa3+/+），APP/PS1（APP/PS1+/--Saa3+/+），Saa3-/-（APP/PS1-/--Saa3-/-）和APP/PS1-Saa3-/-（APP/PS1+/--Saa3-/-），并饲养至12月龄进行后续实验。实验过程中所用到的转基因和基因敲除小鼠，均采用提取鼠尾组织DNA，通过PCR技术鉴定小鼠的基因型。

2.1.2 ICV注射链脲佐菌素的AD小鼠模型构建及分组 通过立体定向小鼠的ICV注射STZ建立散发型AD（sporadic AD，sAD）小鼠模型。将6月龄的Saa3-/-小鼠和同窝对照WT小鼠分别随机分为2组，小鼠腹腔注射5 mg/mL戊巴比妥钠溶液麻醉后，将小鼠固定在立体定位仪上。ICV注射STZ（3.0 mg/kg）或等体积的无菌生理盐水，即得到4组受试小鼠Saa3-/--Saline，Saa3-/--STZ，WT-Saline和WT-STZ。侧脑室坐标为：以前囟点（bregma）为原点，后方-0.3 mm，左/右±1.0 mm和下方-2.5 mm。手术完成后将小鼠置于加热垫（37℃）上，直到其从手术中恢复，方可正常饲养。每周测量小鼠的体重1次。ICV注射6周后，4组受试小鼠接受一系列的行为学测试，测试后处死取脑进行后续的生物学实验。

2.2 转棒式疲劳仪检测小鼠的运动协调和平衡能力

采用转棒式疲劳仪来检测小鼠的运动协调和平衡能力。实验前对小鼠进行运动能力训练。测试仪在90 s内，速度从5 r/min稳定增速至30 r/min，随后速度保持不变。记录小鼠掉落、停止攀爬或不能保持身体平衡时的转速和时间。每只小鼠实验后用75%酒精清理仪器。一共分3次实验，每只小鼠的实验间隔时间为10~15 min。

2.3 旷场实验检测小鼠的自主运动能力

采用旷场实验检测小鼠在一个的自主运动能力。旷场实验测试设备是一个长、宽均为80 cm，高度为30 cm的白色塑料箱，将中央区域40 cm的正方形定义为中心区域。实验时将每只小鼠分别放在角落，并允许其自由探索15 min。观察15 min内小鼠的运动轨迹，记录每只小鼠的运动总路程。每只小鼠实验结束后用75%酒精清理仪器。

2.4 高架十字迷宫检测小鼠的焦虑情绪

采用高架十字迷宫检测小鼠的焦虑情绪。高架十字迷宫由两个开臂（30 cm×5 cm）、两个闭臂（30 cm×5 cm×20 cm）和中央区（5 cm×5 cm）组成。小鼠具有嗜暗性，因此会倾向于在闭臂运动，但是由于自身探究性又会在开臂中活动。实验时将每只小鼠前爪置于中央区域且面朝开臂放入迷宫中，允许其在迷宫内自由探索8 min，记录小鼠在两个开臂中运动的总时间。每只小鼠实验结束后用75%酒精清理仪器。

2.5 Morris水迷宫实验检测小鼠的认知能力

采用水迷宫实验检测小鼠的空间学习记忆能力。该实验在直径150 cm的恒温蓄水池中进行，水池充满无毒白色涂料并保持室温。实验前1~5 d为获得性训练，将平台固定在目标象限内，每天将小鼠随机分配到水池的4个象限中，每天训练4次。若小鼠在90 s内找到平台并停留10 s，摄像装置会自动停止并记录时间。若小鼠90 s后仍未找到平台，实验人员则需要引导小鼠上台并停留20 s。第6天为探寻实验，移除水下平台，记录小鼠在60 s内的运动轨迹，分析受试小鼠在之前平台所在象限中的游泳时间或距离占所有象限总游泳时间或距离的百分比。

2.6 免疫荧光实验探究Saa3在AD模型小鼠脑内的表达及分布

行为学实验后，颈椎脱臼处死受试小鼠，取其左脑组织制备冰冻切片后置于-20℃冰箱中待用。将存放于抗冻剂中的组织切片用0.5 mol/L TBS漂洗3次，每次5 min。加入含2.5% FBS，以0.05 mol/L TBS溶液配制的组织封闭液于室温条件下封闭30 min后，加入Saa3一抗（1∶200）稀释液200µL，4℃孵育过夜。0.5 mol/L TBS漂洗3次后，室温下避光孵育Alexa Fluor®488抗兔IgG荧光二抗（1∶500）1 h。0.5 mol/L TBS漂洗3次后，用ddH2O现用现配的DAPI染色液室温下避光孵育10 min，再次加入TBS溶液漂洗3次，每次10 min。将脑片转移到组织载玻片上，加入封片剂并用盖玻片封片，随后在激光共聚焦显微镜下观察和拍摄。

2.7 Western blot检测小鼠脑组织tau蛋白磷酸化水平

颈椎脱臼处死受试小鼠后，取其右脑组织制成匀浆液。采用BCA蛋白定量试剂盒，将匀浆蛋白浓度定量至6µg/µL。进行蛋白免疫印迹实验，并孵育相应的一抗，包括GAPDH抗体（1∶20 000）、β-Actin抗体（1∶25 000）、Tau5抗体（1∶1 000）、磷酸化tau pS199（1∶1 000）、pT205（1∶1 000）、pS396（1∶1 000）和pS404（1∶1 000）抗体，4℃孵育过夜。TNET洗膜3次后，加入相应的二抗（1∶20 000），室温避光孵育1 h。TNET洗膜3次后，用红外荧光扫描系统曝光。以总Tau蛋白做归一化，采用Image J软件对tau的磷酸化水平进行定量分析。

2.8 数据分析

所有数据均以±s,表示，当P<0.05时具有统计学意义。两组间数据使用t检验分析，多组间数据使用单因素方差分析（One-Way ANOVA）分析检验。所有分析和绘图均使用统计软件GraphPad Prism 8。

3 结果

3.1 AD模型小鼠脑内Saa3表达显著增加

免疫荧光结果及定量数据显示，与WT-Saline组小鼠相比，WT-STZ组小鼠海马区（CA1，CA3和DG）和皮层区的Saa3表达显著增加（图1-A，C）。同样，与同月龄同窝对照WT小鼠相比，Saa3在APP/PS1组小鼠的海马和皮层的表达也显著增加，统计学分析有显著性差异（图1-B，D）。这些结果表明在AD病理条件下，Saa3在脑内被显著诱导表达，提示Saa3可能参与AD的病理进程。

3.2 ICV注射STZ小鼠造模期间体重变化

采用ICV注射方式造模的AD小鼠，注射当日（第0天）称量小鼠的体重，其后每周称量1次小鼠的体重，直到第42天造模期结束。小鼠体重变化如图2所示：WT小鼠中ICV注射STZ小鼠在术后出现轻微的体重下降，之后未见回升；而ICV注射生理盐水小鼠在术后出现体重下降，并在第3周开始显著回升并持续稳定增加。在Saa3-/-小鼠中，ICV注射STZ与生理盐水小鼠体重变化相似，均未见显著的体重下降。这些结果表明，STZ造模成功，Saa3缺失缓解了ICV注射STZ导致的小鼠体重减轻。

3.3 Saa3缺失对小鼠的运动协调和平衡能力的影响

通过疲劳转棒实验检测Saa3缺失对AD小鼠运动协调能力和平衡能力的影响。由结果可知，与两种模型的对照组小鼠相比，ICV注射STZ模型小鼠和APP/PS1小鼠的掉落时间均有降低的趋势。而Saa3缺失对于正常小鼠和两种模型组的小鼠的掉落时间均无显著性影响（图3）。结果表明，Saa3缺失对小鼠的运动协调和平衡能力没有显著影响。

3.4 Saa3缺失对小鼠的自主运动能力的影响

旷场实验用来检测实验动物在新异环境中的自主运动行为和探索能力，自主运动障碍的小鼠总运动路程会减少。如图4-A所示，ICV注射STZ造模的4组受试小鼠15 min内自主运动的总路程没有显著变化。同样，Saa3缺失对WT组小鼠及APP/PS1组小鼠自主运动的总路程无显著性影响（图4-B）。这些结果表明Saa3缺失对小鼠的自主运动能力没有影响。

3.5 Saa3缺失对小鼠的焦虑行为的影响

高架十字迷宫利用小鼠的探索天性和对高悬开臂的恐惧形成行为对比，检测小鼠的焦虑程度。小鼠在开臂活动时间与焦虑程度呈负相关，即开臂停留时间越短表明小鼠的焦虑情绪越严重。WT-STZ组小鼠和APP/PS1小鼠在开臂活动的时间分别少于WT-Saline组小鼠和WT同窝对照小鼠（图5），提示两种AD模型小鼠的焦虑程度均增加。而无论是ICV注射STZ模型还是APP/PS1模型，Saa3缺失均显著增加了小鼠在开臂的活动时间（图5）。这些结果表明，Saa3缺失缓解了AD小鼠的焦虑程度。

3.6 Saa3缺失对AD小鼠的学习记忆能力的影响

Morris水迷宫是检测小鼠空间学习记忆能力的常用实验方法［12］。如图6所示，两种AD模型的对照组小鼠均表现出较好的学习记忆能力，在第1~5天的训练期中表现为较快地找到逃脱平台，即潜伏期较短，上台前的游泳路程较少。与对照组ICV注射生理盐水小鼠相比，ICV注射STZ小鼠找到平台的潜伏期明显增加，统计学分析有显著性差异（图6-A）。而Saa3缺失显著降低了ICV注射STZ小鼠找到平台的潜伏期和游泳路程，并在第4天和/或第5天有显著性差异（图6-A，B）。同样，APP/PS1小鼠需要比同窝对照WT小鼠花费更多的时间和游泳距离找到平台，而Saa3缺失显著降低APP/PS1小鼠第3天和第5天上台前的游泳路程，上台潜伏期有降低趋势（图6-C，D）。这些结果表明，Saa3缺失改善了AD小鼠的学习能力。

Figure 1 Up-regulation of Saa3 in the hippocampus and cortex of APP/PS1 transgenic mice and intracerebroventricular streptozotocin injection mice(±s,,n=3-4)

第6天的探寻实验用来检测小鼠的空间记忆能力。结果如预期，ICV注射STZ和APP/PS1小鼠在目标象限中游泳时间（图6-E，G）或路程（图6-F，H）占所有象限的总时间或总路程的百分比，与相应的对照组小鼠相比显著降低。而对于Saa3缺失的小鼠，这两种AD模型组与对照组相比，小鼠在目标象限中游泳的时间（图6-E，G）或路程（图6-F，H）并没有显著变化，提示Saa3缺失能够改善AD小鼠的记忆能力。

Figure 2 Saa3 deficiency attenuates the decrease in body weight of intracerebroventricular streptozotocin injection mice(±s,,n=11-13)

Figure 3 Effect of Saa3 deficiency on the motor coordination and balance of Alzheimer′s disease(AD)mice(±s,,n=8-11)

Figure 4 Effect of Saa3 deficiency on the spontaneous exploratory activities of AD mice

Figure 5 Effect of Saa3 deficiency on the anxiety of AD mice

Figure 6 Effect of Saa3 deficiency on the cognitive impairment of AD mice

3.7 Saa3缺失对AD小鼠脑内tau蛋白的磷酸化水平的影响

近年来，越来越多的研究表明tau病理与AD的认知功能障碍密切相关［13］。本研究检测了总tau蛋 白（Tau5）以 及tau蛋 白Ser199、Thr205、Ser396和Ser404位点的磷酸化水平，这些位点已经被证实在AD病理条件下被高度磷酸化［14］。如图7所示，WT-STZ小鼠在Ser199、Thr205、Ser396和Ser404位点的磷酸化水平与WT-Saline小鼠相比，均有不同程度的增加。而Saa3缺失降低了WT-STZ小鼠脑内tau蛋白这4个位点的磷酸化水平。同样，APP/PS1小鼠与WT小鼠相比，脑内tau蛋白Ser199、Thr205、Ser396和Ser404位点的磷酸化水平显著升高。而Saa3缺失降低了APP/PS1小鼠脑内tau蛋白Thr205和Ser396两个位点的磷酸化水平。这些结果说明，Saa3缺失降低了AD小鼠脑内tau蛋白特定位点的磷酸化水平。

Figure 7 Effect of Saa3 on tau hyperphosphorylation in the brain of AD mice using Western blots(±s,,n=4-6)

4 讨论

SAA是一种急性时相反应蛋白，具有多种免疫功能。已发现SAA在阿尔茨海默病患者的大脑中表达升高［15］。有研究构建肝特异性过表达Saa1的转基因小鼠（TG），发现肝脏来源的Saa1能够迁移到小鼠的脑内，并伴随脑内小胶质细胞的增殖、促炎细胞因子的表达以及纤维状Aβ的沉积［16］。这些结果表明SAA可能参与AD的病理过程。到目前为止，SAA在AD等中枢神经退行性疾病中的研究相对较少。本研究采用Saa3基因敲除小鼠构建了两种AD小鼠模型，通过免疫荧光实验发现Saa3在这两种AD模型小鼠脑内的海马和皮层区的表达较WT对照组均有显著增加，说明Saa3在脑内被诱导表达，提示其可能参与AD的发生发展。

进行性发展的认知功能障碍是AD患者的主要临床症状［1］。本研究使用了两种AD模型，APP/PS1双转基因小鼠和侧脑室注射链脲佐菌素（ICVSTZ）小鼠模型，评估Saa3缺失对小鼠学习记忆能力的影响。这两种小鼠模型分别是典型的家族性AD和散发性AD的实验动物模型，被广泛用于AD的研究［17-18］。研究结果发现，在Morris水迷宫实验中，ICV注射STZ小鼠和APP/PS1小鼠与各自的对照组小鼠相比，表现出明显的空间学习和记忆功能受损。这个结果与之前文献报道的结果一致［19-20］。并且，Saa3的缺失改善了ICV注射STZ小鼠和APP/PS1小鼠的学习记忆功能损伤。这些结果表明抑制SAA可能能够抑制或减缓AD的认知功能障碍。

本研究还记录了ICV注射STZ模型小鼠的体重变化。结果显示Saa3缺失缓解了ICV注射STZ小鼠的体重减轻。课题组之前的研究发现巨噬细胞游走抑制因子（macrophage migration-inhibitory factors，MIF）的缺失逆转了ICV注射STZ小鼠的体重减轻［21］。这些数据提示炎症相关因子或受体可能参与ICV注射STZ小鼠的体重调节。

此外，本研究通过旋转棒疲劳仪、旷场实验和高架十字迷宫实验检测了小鼠运动协调和平衡能力、自主运动能力和焦虑程度来评估小鼠非认知行为的变化。结果表明，Saa3缺失对于对照组小鼠和AD模型小鼠的运动协调和平衡能力及自主运动能力均无显著影响。而Saa3缺失减轻了ICV注射STZ小鼠和APP/PS1小鼠的焦虑程度。对抑郁症模型小鼠的小胶质细胞进行转录组学分析发现，与对照组相比差异最大的基因中，Saa3的表达水平显著增加，提示Saa3可能会影响抑郁样行为［22］。除了记忆等认知功能障碍，AD患者还表现出冷漠、抑郁、进食和睡眠障碍及攻击性行为等非认知症状［23］。因此，对AD非认知行为障碍的深入探究也是AD研究的一个重要方向。本研究结果提示，抑制SAA可能能够缓解AD的焦虑症状。

越来越多的证据表明AD认知功能的紊乱和tau蛋白的病理进程密切相关［24］。为了深入探究Saa3缺失缓解认知功能障碍的可能机制，本研究检测了AD模型小鼠脑内tau蛋白的磷酸化水平。相较于对照组小鼠，ICV注射STZ小鼠和APP/PS1小鼠脑内的tau蛋白在Ser199、Thr205、Ser396和Ser404 4个位点均有不同程度的过度磷酸化。而Saa3缺失降低了ICV注射STZ小鼠脑内tau蛋白在4个位点的磷酸化水平，并降低了APP/PS1小鼠Thr205和Ser396位点的过度磷酸化。这些结果说明Saa3参与调节AD小鼠脑内tau蛋白特定位点的磷酸化水平，进而影响tau蛋白的病理进程。而Saa3缺失影响AD小鼠tau蛋白磷酸化水平改变的具体机制还有待进一步探究。综上所述，本研究通过构建两种经典的AD模型小鼠，证实了Saa3参与调节AD的认知功能障碍和tau蛋白的病理进展。同时，SAA通过激活p38 MAPK信号通路抑制星形胶质细胞向Aβ斑块的迁移和募集［8］。因此，抑制SAA可能为AD的预防和治疗提供了一个新的潜在靶标。