半胱氨酸代谢途径调控与肿瘤治疗新策略

解 放，刘 楠

（中国药科大学生命科学与技术学院，南京 211198）

自1920年奥托·瓦伯格发现瓦伯格效应，肿瘤代谢重编程的研究已经超过了一百年。肿瘤代谢重编程是肿瘤发生、发展过程中关键特征之一［1-2］。肿瘤细胞的快速增殖需要相应的能量和物质基础，进而促进肿瘤生长。大量研究表明，除了糖代谢异常外，氨基酸代谢及脂质代谢异常也是肿瘤代谢重编程的重要研究范畴。本文将结合半胱氨酸在肿瘤细胞中的转运方式和代谢途径，分析半胱氨酸对肿瘤各个阶段的调控机制，介绍相应的抗肿瘤靶向疗法的最新进展。

1 半胱氨酸代谢途径

近年来的研究表明，谷氨酰胺是潜在的肿瘤生物标志物［3-4］，精氨酸代谢则与肿瘤产生机制有关［5］，针对溶质载体家族6成员14（SLC6A14）的药物α-甲基色氨酸可用于肿瘤靶向治疗［6］。可见特定氨基酸代谢在肿瘤的发生发展、肿瘤微环境和肿瘤免疫治疗等方面发挥重要作用。靶向肿瘤依赖性的氨基酸代谢，发展新型药物，可有效抑制肿瘤的生长。半胱氨酸是一种非必需中性氨基酸，为三羧酸循环提供碳源，参与合成谷胱甘肽维持氧化还原平衡，同时其巯基可生成硫化氢促进ATP的生成［7］。肿瘤细胞自身转硫途径合成的半胱氨酸无法满足其快速增殖的需求，要通过增加膜上的转运体从胞外摄入胱氨酸。肿瘤细胞中半胱氨酸则主要来源于胱氨酸转运体的转运和内源性转硫途径的合成两部分。

1.1 胱氨酸转运蛋白家族

半胱氨酸在肿瘤细胞外主要以胱氨酸（Cys-SS-Cys）形式存在，经胱氨酸转运体转运至细胞内，由于细胞内呈高度还原状态，胱氨酸被还原成半胱氨酸，参与合成谷胱甘肽（GSH）、硫化氢（H2S）、3-巯基丙酮酸、同型半胱氨酸等有机物，介导肿瘤的增殖、生长、转移和耐药［8-9］。胱氨酸/谷氨酸转运体（System xc-）是由轻链SLC7A11（solute carrier family 7，member 1）和重链SLC3A2（solute carrier family 3，member 2）通过二硫键组成的异二聚体，在胰腺癌、结直肠癌细胞中高表达。轻链SLC7A11属跨膜结构蛋白，N端和C端均位于细胞质内，其余部分穿梭于细胞膜。重链亚基SLC3A2负责维持System xc-的稳定性和膜定位。此外，SLC3A2还可与其他氨基酸转运蛋白构成多聚体，如与SLC7A5共同组成氨基酸-多胺-有机阳离子转运体，参与催化甲状腺激素、药物和激素前体的跨膜运输［10］，调控Hippo和mTOR通路［11］。半胱氨酸也可藉由Na+依赖性的丙氨酸-丝氨酸半胱氨酸转运蛋白SLC1A4、SLC1A5、SLC3A1和兴奋性氨基酸转运蛋白SLC1A1等非特异性转运体进入细胞［12-13］，氨基酸转运蛋白信息见表1。

表1 胱氨酸转运蛋白列表

免疫组织化学实验显示，乳腺癌组织中SLC3A1表达量为癌旁组织的1.5倍，Kaplan-Meier生存分析发现，SLC3A1高表达的Ⅲ期患者生存率较低表达的患者减少20%，表明SLC3A1介导的半胱氨酸摄取促进乳腺癌进展［14］。SLC1A1的445位精氨酸突变为色氨酸和395位异亮氨酸缺失突变则降低SLC1A1对谷氨酸和半胱氨酸的转运效率，导致二羧酸氨基酸尿症。除这些中性氨基酸之外，SLC1A5高亲和性地运输L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺，有助于维持神经元和神经胶质细胞的谷氨酰胺稳态［15］。在敲除SLC1A5的舌鳞癌SCC15和UM1细胞中，发现细胞摄取谷氨酰胺减少，裸鼠肿瘤生长受抑制，说明SLC1A5具有良好的抗肿瘤潜力，可作为口腔鳞状细胞癌的新靶点［16-17］。

1.2 转硫途径

肿瘤细胞内半胱氨酸的水平不仅依赖于胱氨酸转运蛋白的导入也与内源性转化，即将甲硫氨酸转化为半胱氨酸的转硫途径密切相关。转硫途径中，甲硫氨酸经S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷-L-同型半胱氨酸转化成同型半胱氨酸，在胱硫醚-β-合成酶（cystathionineβ-synthase，CBS）催化下与丝氨酸缩合生成胱硫醚，再经胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionineγ-lyase，CSE）生成半胱氨酸，生成的半胱氨酸除了用于谷胱甘肽合成，还可用于含硫分子合成，经半胱氨酸双加氧酶（cysteine dioxygenase，CDO）、半胱氨酸亚磺酸脱羧酶和次牛磺酸脱氢酶生成牛磺酸［18］，见图1。

图1 半胱氨酸代谢途径

转硫途径与卵巢癌［19］、结肠癌［20］的能量代谢、肿瘤血管新生及肿瘤耐药有关。GCN2-ATF4通路可根据细胞内空载的tRNA含量判断氨基酸供应是否充足进而调控下游的转录因子ATF4的转录活性。Zhu等［21］通过染色质免疫沉淀发现半胱氨酸饥饿条件下，人恶性黑色素瘤细胞SKMEL30和人胶质母细胞瘤细胞LN229中，ATF4均与CBS和CSE的启动子区域结合；使用CRISPR-Cas9技术敲除ATF4后，半胱氨酸饥饿时SKMEL30细胞中CBS、CSE的表达无明显变化。用半胱氨酸饥饿处理SKMEL30和LN229，CBS、CSE、ATF4表达增加，GCN2磷酸化水平升高，表明在半胱氨酸饥饿下，GCN2-ATF4通路被激活，从而上调CBS、CSE表达，转硫途径占优。

CBS是抑癌因子HNF4α介导的肝癌上皮间质转化抑制的主要效应物。单独敲低半胱氨酸代谢途径酶CBS和CDO1的肝癌细胞HepG2，E-钙黏蛋白CDH1减少但波形蛋白VIM增加，诱导细胞迁移。说明转硫途径显著抑制HepG2的上皮-间质转化（EMT）和细胞迁移。培养基中回补代谢物牛磺酸、胱硫醚等，细胞迁移受到抑制。推测CBS活性增强后会调节4种主要代谢物（丝氨酸、胱硫醚、同型半胱氨酸和H2S）的含量变化，进而影响EMT和相关的耐药性，并最终影响肿瘤的生长和进展［22］。然而CBS以及转硫途径调控肿瘤发生发展的作用并没有明确结论，存在两面性。Szabo等［20］采用敲低CBS或使用CBS抑制剂氨基羟乙酸AAOA处理人结肠癌细胞HCT116，显著降低HCT116异种移植小鼠体内肿瘤的生长速率和体积，同时，降低肿瘤组织内CD31阳性血管密度血流量，抑制肿瘤血管新生。综上说明与CBS相关的肿瘤发生发展根据肿瘤类型的不同，存在双向性调控。

相较于胱氨酸转运体介导的较单一内源性途径，转硫途径涉及的化合物、酶和副产物众多，在半胱氨酸代谢途径调控中占据了主导地位，研究转硫途径中各类前体、代谢产物、副产物的产生和作用机制具有重要意义。

2 半胱氨酸代谢途径在肿瘤发生发展中的调控作用

以半胱氨酸为中心的代谢网络，涉及多种代谢物和酶参与氧化应激、能量代谢、细胞自噬的调控。研究半胱氨酸代谢调控肿瘤发生发展的机制，为开发和改进肿瘤诊断工具和肿瘤靶向药物提供了可能性。

2.1 半胱氨酸代谢与氧化应激

氧化应激是肿瘤细胞重要的生物学特征之一。肿瘤细胞往往具有较高的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，从而造成氧化应激。一定阈值的氧化应激可调节ROS参与激活细胞增殖、分化、衰老、转录因子调节等其他调节通路［23］，而在活性氧浓度急速升高等过度应激条件下，ROS打破细胞内氧化还原平衡，诱导细胞发生凋亡、坏死［24］。因此肿瘤细胞在较高ROS水平时，会激活细胞内抗氧化系统提高GSH的产生速率，以维持胞内的氧化还原状态。

在肿瘤细胞中ATP依赖性的谷氨酸-半胱氨酸连接酶（glutamate-cysteine ligase，GCL）催化半胱氨酸与谷氨酸结合生成γ-谷氨酰半胱氨酸，谷胱甘肽合成酶（glutathione synthase，GS）催化甘氨酸与γ-谷氨酰半胱氨酸结合最终生成谷胱甘肽［25］。GCLM是GCL的调节亚基，基因敲除GCLM小鼠的定量代谢组学，发现GSH降低，谷氨酸和胱氨酸水平升高，抑制GSH的合成可导致活性氧积累，胃癌细胞死亡［26］。ATF3是ATF/CREB转录因子家族成员，可由DNA损伤、氧化应激和细胞损伤诱导激活。研究发现，在铁死亡激活剂Erastin处理的人纤维肉瘤细胞HT1080中，ATF3表达增加，C11-BODIPY检测的脂质过氧化物水平升高30%；敲除ATF3后，GSH水平提高［27］，全基因组芯片序列分析显示，ATF3以p53非依赖性的方式与SLC7A11启动子结合，并抑制SLC7A11的转录功能。说明氧化还原相关转录因子ATF3通过调控SLC7A11进而调节GSH，阻断脂质过氧化过程以应对氧化压力。通过阐明肿瘤细胞以调控半胱氨酸转运能力来平衡细胞内氧化还原水平的分子机制，有望发现氧化应激相关的潜在靶点。

2.2 半胱氨酸代谢与能量代谢

肿瘤细胞需要一定浓度的NADPH以维持细胞内能量代谢平衡。与正常细胞类似，肿瘤细胞的NADPH来自于磷酸戊糖途径和柠檬酸-丙酮酸循环，而脂肪酸、GSH合成等会消耗NADPH，并且在胱氨酸转运进入细胞后，胱氨酸与消耗NADPH，生成NADP+和半胱氨酸。Liu等［28］发现，葡萄糖转运蛋白GLUT的靶向抑制剂KL-11743处理肺鳞癌异种移植小鼠，KL-11743处理组磷酸戊糖中间体6-磷酸葡萄糖减少50%，高表达SLC7A11肿瘤中NADP+/NADPH比率显著提高，说明高表达SLC7A11的肿瘤对GULT抑制更加敏感。同时，在肾癌786-O细胞中葡萄糖饥饿限制磷酸戊糖途径，显著提高胱氨酸饥饿敏感的胱氨酸水平，γ-谷氨酰胱氨酸（γ-glutamylcystine）等二硫化合物积累，NADP+/NADPH比率增加，可见胱氨酸和其他二硫化物的积累、NADPH耗竭、葡萄糖饥饿等多种原因共同引起肿瘤细胞死亡。说明通过耗竭胱氨酸代谢与能量代谢交点的NADPH可以促进肿瘤细胞发生能量紊乱，进而促进肿瘤死亡。

2.3 半胱氨酸代谢与细胞自噬

自噬是细胞在营养压力、低氧应激条件下维持自身稳态的调节机制，主要通过泛素蛋白酶体和溶酶体两种途径，降解非必要组分以获得氨基酸等营养物质和能量，是细胞对抗外界不利环境的自我保护手段。当半胱氨酸缺乏时，肿瘤细胞可藉由溶酶体途径降解无用的蛋白质而获得半胱氨酸，通过溶酶体胱氨酸转运蛋白（cystinosin，CTNS）将半胱氨酸转出溶酶体［29-30］，以在半胱氨酸缺乏的条件下获得半胱氨酸。半胱胺是一种氨基硫醇类化合物，最初用于治疗胱氨酸积聚于溶酶体导致的胱氨酸病，近年因具有可诱导形成自噬降解活性，而用于肿瘤治疗［31］。Fujisawa等［32］发现，半胱胺可抑制人胰腺癌细胞MIA PaCa-2的迁移和侵袭，胰腺癌荷瘤小鼠给药250 mg/kg半胱胺连续30 d，肿瘤转移的总重量减少约90%。Andrzejewska等［33］通过免疫共沉淀和质谱检测发现，CTNS与mTORC1信号通路的p18，p14和Mp1蛋白质相互作用。免疫荧光显示在回补半胱氨酸后，敲除CTNS的肾外皮细胞中mTOR途径仍处于下调状态，说明CTNS在mTORC1信号通路中作用于Rags的上游。通过对CTNS进行干扰，实现从自噬通路mTOR途径的源头调节。

3 靶向半胱氨酸代谢途径的肿瘤治疗

抗肿瘤治疗包括放疗、化疗和免疫疗法等，但由于靶向性欠佳以及耐药等问题，如何延长肿瘤患者生存期并提高生存质量已成为亟待解决的临床难题。半胱氨酸代谢的多种酶和代谢物是潜在的治疗靶点，研究半胱氨酸代谢途径为肿瘤治疗和新药研发提供重要方向（表2）。

表2 靶向半胱氨酸代谢的肿瘤治疗

3.1 靶向CSE的肿瘤治疗

CSE是转硫途径生成半胱氨酸的关键酶，在肿瘤细胞增殖、迁移、远端转移方面发挥重要作用。Youness等［34］对80位乳腺癌患者活检组织进行了qPCR分析，显示乳腺癌组织中CSE的mRNA含量是同一患者正常乳腺组织的4倍，且高肿瘤增殖指数（Ki-67）中的CSE水平也相应增加。金精三羧酸选择性结合CSE活性位点的Arg和Tyr残基，抑制其活性。Wang等［35］对肿瘤基因组数据库（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的469份前列腺癌样本和50份正常组织标本进行生物信息学分析，CSE在前列腺癌组织中呈高表达水平，8年随访的生存曲线表明，高表达CSE的患者生存率低于低表达组，低表达组生存期延长了20个月。胰腺癌和低度神经胶质瘤患者中也发现同样规律。敲低CSE的前列腺癌细胞PC3，IL-1β减少，说明CSE通过抑制NF-κΒ-IL-1β介导的信号通路抑制侵袭。敲低CSE的PC3细胞原位移植到裸鼠上，60 d肿瘤体积约为未敲除组50%，主动脉淋巴结转移发生率为40%，仅是未敲除组一半。虽然在不同肿瘤中都高表达，是一种潜在的肿瘤治疗靶点，但针对CSE的抑制剂及治疗方法尚处于实验室研究阶段。

3.2 靶向GPX4的肿瘤治疗

谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）是含硒的磷脂过氧化酶，通过将脂质氢过氧化物还原为脂质醇，维持胞内的还原状态，保护细胞免受脂质过氧化引起的铁死亡。最新研究发现，疱疹病毒HSV-1感染的小鼠GPX4通过抑制细胞膜脂质过氧化激活cGAS-STING通路，GPX4失活则导致脂质过氧化产生，使得STING第88位半胱氨酸发生羰基化，抑制STING棕榈酰化和由内质网向高尔基体的转位［36］。双敲除GPX4和KRAS的胰腺癌小鼠肿瘤转移至肝和肺，转移率为50%，而对照组转移率为20%。敲除GPX4小鼠血清中DNA氧化损伤产物8-OHG增加，免疫荧光显示胰腺癌小鼠组织中cGAS与DNA结合启动STING依赖性反应，从而促进巨噬细胞浸润和活化［37-38］。

烷化剂RSL3和ML162都是GPX4抑制剂，通过活化的烷基氯与催化中心的硒代半胱氨酸残基共价结合。RSL3可以诱导顺铂耐药头颈癌HN3细胞发生内质网应激，通过PERK-ATF4-SENSN2途径表达p62，细胞对化疗药物敏感性增加，敲低GPX4显著提高了RSL3耐药的HN3细胞对RSL3的敏感性［39］。ML162则使乳腺癌细胞GPX4活力降低50%。肿瘤内给药每周50 mg/kg处理MDAMB-231原位乳腺癌小鼠2周，肿瘤重量较对照组减半［40］。但是这些烷化剂的药代动力学性质不佳，稳定性差，ML210则是一种新型抑制剂，需在细胞内转化为α-硝基酮肟JKE-1674，JKE-1674发生脱水反应生成不稳定的呋喃杂环，开环异构化生成选择性结合GPX4硒代半胱氨酸残基的腈氧亲电体。与其他选择性和稳定性较差的GPX4抑制剂不同的是，LC-MS监测小鼠经口给予ML210后24 h内血浆稳定性高达99%，全基因组CRISPR文库筛选证明ML210具有更高的选择性［41］。可见针对GPX4及其药物筛选的研究将是未来新药研发的重点之一。

3.3 靶向System xc-的肿瘤治疗

System xc-属于异二聚氨基酸转运蛋白家族，由轻链SLC7A11和重链SLC3A2组成，负责将外源的胱氨酸转运进入细胞，将细胞内等比例的谷氨酸转运至细胞外。近年研究发现System xc-在非小细胞肺癌、口腔癌、前列腺癌、恶性神经胶质瘤等肿瘤中高表达，与肿瘤的增殖、侵袭、转移和耐药密切相关［42］。

免疫疗法包括免疫检查点的抑制剂与过继细胞疗法（CAR-T），在肿瘤免疫中得到广泛应用，已成为肿瘤治疗的支柱之一［43-44］。抗CTLA4的免疫治疗激活CD8+T释放IFNγ，放疗和IFNγ联合治疗通过ATM和STAT1信号协同抑制从而下调System xc-的表达，大大减少人纤维肉瘤细胞中胱氨酸的摄取［45］。Wang等［46］发现，使用PD-L1抗体治疗黑色素瘤小鼠，激活的CD8+T细胞通过IFNγ驱动脂质过氧化，从而造成脂质过氧化物在肿瘤细胞中积累，抑制System xc-的表达使肿瘤细胞发生铁死亡。除免疫疗法外，临床使用索拉非尼、柳氮磺吡啶、兰吡立松靶向System xc-治疗前列腺癌、肝癌等疾病已见成效［47］。这提示靶向System xc-的肿瘤治疗可以与免疫治疗联用，多类型药物之间互为补充，增强靶向肿瘤细胞的精准程度。目前针对以System xc-为靶点的肿瘤免疫治疗研究相对较少，针对System xc-的免疫应答进行深入的理论研究，有望为未来肿瘤研究提供新的方向。

4 总结与展望

半胱氨酸是一种生物体内常见的氨基酸，在氧化应激、能量代谢、细胞铁死亡、细胞自噬方面发挥着重要作用。包含多种代谢产物和副产物的半胱氨酸代谢途径促进或抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭，为肿瘤研究提供了新的方向。通过调控半胱氨酸代谢网络中的代谢物和酶，从而实现对肿瘤病理活动的调节，以此进行基础理论研究发现潜在的药物靶点，具有广阔的前景和临床意义。