TRIM55基因敲除小鼠建立及鉴定

赵晓杰， 布雨鑫， 闫承慧， 刘 丹

北部战区总医院 心血管内科，辽宁 沈阳 110016

TRIM55是近年发现的横纹肌特异性泛素连接酶[1-2]。人TRIM55基因定位在8号染色体上，共含10个外显子，可编码548个氨基酸[3]。TRIM55主要表达于骨骼肌和心脏[4-5]，在心肌和骨骼肌的肌节组装、肌肉结构和功能的维持中发挥重要作用，还可以调控骨骼肌细胞分化、影响心肌细胞线粒体自噬[6-7]。此外，TRIM55点突变与肥厚型心肌病的发病、临床症状密切相关，其多态性位点还与心力衰竭发病有关[8-9]。本研究旨在建立及鉴定TRIM55基因敲除小鼠，为深入阐明TRIM55在心脏和骨骼肌中的作用及机制提供新的工具。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 TRIM55抗体(英国Abcam)；β-actin抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；HRP标记的二抗(美国Jackson Immuno Research)；逆转录试剂盒(日本TAKARA)；蛋白裂解液RIPA(美国Thermofisher Scientific)；引物合成(生工生物工程股份有限公司)。

1.2 实验动物及配繁方案 3只雄性TRIM55杂合子小鼠和10只雌性C57BL/6J小鼠均购于江苏集萃药康生物科技有限公司。首先，将雄性TRIM55杂合子小鼠与雌性C57BL/6J小鼠进行交配，获得雌性TRIM55杂合子小鼠；再将雄性TRIM55杂合子小鼠与雌性TRIM55杂合子小鼠进行交配，以获得TRIM55基因敲除小鼠。

1.3 基因型鉴定 子代小鼠满4周时分笼并打耳钉进行编号。提取鼠耳基因组DNA，具体方法如下：将小鼠耳放于裂解液中(含蛋白酶K)，55℃水浴锅2 h，95℃水浴锅5 min终止消化，13 000 r/min离心5 min，上清即为提取的DNA。然后进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增，引物见表1。反应体系：gDNA Template2 μl，10×Taq master mix10 μl，Primer mix(10 M)1 μl，H2O补至20 μl。反应条件：(1)95℃ 5 min；(2)95℃ 30 s；(3)58℃ 30 s；(4)72℃30 s；(2)～(4)共40个循环；(5)72℃3 min；(6)25℃保持。将扩增后的PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳及基因型鉴定。

表1 TRIM55基因敲除小鼠基因型鉴定引物

1.4 荧光定量PCR检测TRIM55基因表达 选取8周龄雄性TRIM55基因敲除小鼠及野生型小鼠各3只，处死后分离各组小鼠心脏组织和骨骼肌组织，采用Trizol法提取心脏组织和骨骼肌组织的总RNA。按照试剂盒说明书进行逆转录反应。TRIM55正向引物AAAGCAACTGATCTGTCCCATC，反向引物TGTGGGTAAGTACGGGTTAGAG；GAPDH正向引物AGGTCGGTGTGAACGGATTTG，反向引物GGGGTCGTTGATGGCAACA。相对表达量用2-△△CT表示。

1.5 Western Blot检测TRIM55蛋白表达 选取8周龄雄性TRIM55基因敲除小鼠及野生型小鼠各3只，处死后取20 mg心肌组织和20 mg骨骼肌，加入200 μl蛋白裂解液对组织进行裂解，4℃放置30 min，13 000 r/min离心5 min，上清即为提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度。采用SDS-PAGE胶对细胞总蛋白进行电泳。一抗采用抗TRIM55抗体，二抗为HRP标记的抗体，β-actin为内参基因。一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h后洗膜，再用化学发光试剂ECL对条带进行显影。采用Image-Pro Plus 6.0软件对条带进行灰度分析。

2 结果

2.1 获得TRIM55基因敲除小鼠情况 共有孕鼠16只，产仔95只，饲养子代小鼠至4周龄。对子代小鼠进行基因型鉴定，发现3种基因型：野生型22只(23.16%)、TRIM55杂合子24只(25.26%)、TRIM55基因敲除49只(51.58%)。基因型鉴定结果见图1。

图1 小鼠基因型鉴定结果(a.PCR扩增鉴定敲除，基因敲除=260 bp，野生型=1 196 bp；b.PCR扩增鉴定野生型，野生型=351 bp；基因敲除为3、4、5、7，杂合子为1、8、9、11、13，野生型为2、6、10、12)

2.2 小鼠心肌组织和骨骼肌组织TRIM55基因转录水平 TRIM55基因敲除小鼠心肌组织和骨骼肌组织的TRIM55基因转录水平低于野生型，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 荧光定量PCR检测TRIM55基因敲除小鼠心肌组织和骨骼肌组织TRIM55基因转录水平(a.心肌组织；b.骨骼肌组织)

2.3 小鼠心肌组织和骨骼肌组织TRIM55蛋白表达 TRIM55基因敲除小鼠心肌组织和骨骼肌组织的TRIM55蛋白表达低于野生型，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 Western Blot检测TRIM55基因敲除小鼠心肌组织和骨骼肌组织TRIM55蛋白表达(a，c.心肌组织；b,d.骨骼肌组织)

3 讨论

TRIM55主要在心肌和骨骼肌中表达[4-5]，但近年来也有研究报道，TRIM55在其他组织，如肺、肝等中也有表达[10]。TRIM55作为一个E3泛素连接酶，可通过调控下游靶蛋白的泛素化来发挥生物学功能。在小鼠心肌缺血再灌注损伤模型中，TRIM55表达升高，其通过调控靶蛋白DUSP1泛素化水平而影响缺血再灌注损伤后心肌细胞的凋亡[11]。TRIM55在维持骨骼肌细胞的增殖和分化中发挥关键作用，可维持骨骼肌肌动蛋白骨架稳定[12]。此外，TRIM55在肿瘤细胞的增殖和迁移中也扮演重要角色[13]。因此，建立TRIM55基因敲除小鼠模型对于深入明确TRIM55在疾病中的作用并阐明相关机制具有重要意义。

本研究通过雄性TRIM55杂合子小鼠与雌性TRIM55杂合子小鼠交配成功获得TRIM55基因敲除小鼠。荧光定量PCR和Western Blot检测结果显示：TRIM55基因敲除小鼠心肌组织和骨骼肌组织的TRIM55基因转录水平低于野生型，差异有统计学意义(P<0.05)；TRIM55基因敲除小鼠心肌组织和骨骼肌组织的TRIM55蛋白表达低于野生型，差异有统计学意义(P<0.05)。这验证了本研究的基因敲除效率很高，小鼠可用于后续疾病模型及功能学实验。

综上所述，本研究成功建立了TRIM55基因敲除小鼠模型，为深入阐明TRIM55的作用及其机制提供了新的实验工具。