AMOTL2与FKBP51表达水平与胶质母细胞瘤病人预后的关系

刘志峰 陈永汉 姜 浩

胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是恶性程度最高的颅内原发性肿瘤，目前主要行手术治疗联合化疗、放疗等综合治疗，但因肿瘤呈侵袭性生长，彻底切除难度大，术后易复发，预后很差。近年来，研究发现肿瘤组织多种基因呈异常表达[1]。研究发现血管动蛋白（angiomotin，AMOT）家族成员可能具有抑癌或致癌作用，类血管动蛋白-2（angiomotin like-2，AMOTL2）作为该家族的一员，参与肿瘤进展[2]。Takaoka 等[3]发现FK506 结合蛋白51（FK506 binding proteins 51，FKBP51）可通过调节RhoA 和ROCK 蛋白，对细胞运动进行控制，参与肿瘤细胞侵袭、迁移。本文探讨AMOTL2、FKBP51 表达水平与GBM病人预后的关系，为临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 纳入标准：病理诊断证实为GBM；年龄≥18岁；首次就诊，之前无放、化疗等；临床资料完善；签署同意书。排除标准：患其他原发性肿瘤；因GBM 复发入院；患血液系统、自身免疫系统等疾病；入院前3个月内有大手术史；既往有精神障碍、脑血管疾病、脑膜炎等病史。

收集2016 年6 月～2019 年6 月手术切除的GBM标本92例，取同期收治的颅脑损伤内减压术切除的非肿瘤脑组织48 例为对照组。两组基线资料无统计学差异（P＞0.05，表1）。

表1 GBM组织AMOTL2、FKBP51、P53、EGFR的表达变化及IDH1突变情况（例）

1.2 检测方法 采用免疫组化法分析AMOTL2、FK⁃BP51 以及异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydroge⁃nase-1，IDH1）、P53、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）表达情况。组织行石蜡包埋，切片厚度为5 μm。60 ℃烘烤30 min，脱蜡至水化，PBS 洗涤3次×3 min。微波炉内热修复20 min修复抗原，PBS 洗涤3 次×3 min。3%去离子水孵育15 min，PBS 洗涤3 次×3 min。10%山羊血清室温反应15 min。加一抗，37 ℃反应2 h，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3 次×3 min。加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 洗涤3 次×3 min。加入辣根过氧化物酶，37 ℃反应15 min，PBS 洗涤3 次×3 min。DAB 显色后，苏木素复染，干燥、透明、封片，显微镜下观察。

免疫组化染色评分[4]：记录高倍视野（×200）下阳性细胞，以细胞膜、胞浆呈棕黄、棕褐色为阳性（图1）。染色强度：阳性细胞占0～5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分别计0、1、2、3、4 分。显色程度：无显色、淡黄、棕黄以及棕褐色分别计0、1、2、3 分。二者乘积为最终得分，0～2 分为阴性（低表达），≥3分为阳性（高表达）。IDH1突变蛋白主要表达于细胞质内，以所观察视野内可见棕褐色为阳性突变。

图1 免疫组化染色检测GBM组织AMOTL2、FK⁃BP51表达（SP法，×200）

1.3 随访 出院后随访2 年，包括微信、电话、门诊随访等，记录无进展生存期（术后1 d 开始至出现肿瘤进展、复发的时间）、总生存期（术后1 d 开始至死亡的时间）。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0软件分析；计量资料以±s表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验；采用Spearman 相关系数分析相关性；采用多因素Cox 比例回归风险模型分析生存预后的影响因素；生存曲线分析FKBP51、AMOTL2表达水平与病人生存期的关系；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GBM 组织AMOTL2、FKBP51、P53、EGFR 的表达变化及IDH1突变情况GBM组织AMOTL2低表达率明显高于对照组（P＜0.05），FKBP51、P53、EGFR高表达率明显高于对照组（P＜0.05），IDH1突变率明显高于对照组（P＜0.05）。见表1。

2.2 GBM 组织AMOTL2、FKBP51 表达水平与P53、EGFR 表达水平及IDH1突变水平的相关性GBM 组织AMOTL2 表达水平与P53、EGFR 表达水平呈明显负相关（P＜0.05），GBM 组织FKBP51 表达水平与P53、EGFR 表达水平呈明显正相关（P＜0.05）。GBM组织AMOTL2、FKBP51 表达水平与IDH1 突变水平无明显相关性（P＞0.05）。见表2。

表2 GBM 组织AMOTL2、FKBP51 表达水平与P53、EGFR 表达水平及IDH1突变水平的相关性

2.3 GBM 病人生存时间的影响因素 多因素Cox 比例回归风险模型分析结果显示，肿瘤直径≥5 cm、病程时间＞30 d、肿瘤未全切除及P53、EGFR、FKBP51高表达是生存预后不良的独立危险因素（P＜0.05），术后辅助放化疗、IDH1 突变、AMOTL2 高表达是生存预后的保护性因素（P＜0.05）。见表3。

表3 GBM病人生存时间影响因素的Cox比例回归风险模型分析

2.4 FKBP51、AMOTL2 表达水平与病人生存期的关系 生存曲线分析显示，AMOTL2高表达组病人无进展生存期、总生存期较低表达组均明显延长（P＜0.05），FKBP51高表达组无进展生存期、总生存期较低表达组均明显缩短（P＜0.05）。见图2。

图2 生存曲线分析FKBP51、AMOTL2表达水平与病人生存期的关系

3 讨论

GBM 恶性程度高，目前治疗手段有限，预后尚不理想，临床需寻求理想标记物为改善GBM预后提供思路。研究发现，AMOTL2 是泛素特异性蛋白酶9X（ubiquitin-specific protease 9X，USP9X）的靶标，而USP9X 与肿瘤发生有关，AMOTL2 可能通过USP9X 的靶向作用参与肿瘤进展[5]。另有研究认为FKBP51在胶质瘤组织内大量表达，可能通过调节程序性细胞死亡配体1（programmed death ligand-1，PD-L1）发挥作用[6]。本文结果显示，GBM 组织AMOTL2 呈低表达，而FKBP51 呈高表达。Chen 等[7]指出胶质瘤级别越高，AMOTL2表达下调越明显，可调节β-catenin 核转位，影响下游靶基因表达，抑制胶质瘤增殖、侵袭。FKBP51是FK506结合蛋白的成员，能与Beclin-1 结合，使蛋白相互作用改变，对细胞自噬进行调节，影响肿瘤进展[8]。夏志秀等[9]研究显示结直肠癌组织FKBP51 呈明显高表达，浸润越深、肿瘤越大的病人，FKBP51 阳性表达越强。本文结果显示GBM 组织AMOTL2、FKBP51 表达与P53、EGFR 表达有相关性。P53 是p53 基因突变后的产物，对肿瘤细胞增殖无抑制作用，甚至可促进肿瘤进展[10]。EGFR是表皮生长因子家族的重要成员，能将细胞中的传导通路激活，促进肿瘤细胞增殖、迁移[11]。AMOTL2、FKBP51 与P53、EGFR 可能通过不同途径调节GBM细胞增殖。

本文预后分析显示，AMOTL2 高表达、FKBP51低表达病人无进展生存期、总生存期更高。Russo等[12]发现FKBP51 可能通过诱导PDL-1 表达，形成FKBP51/PDL-1轴，影响GBM的耐药信号通路。

总之，GBM 组织AMOTL2 呈低表达，FKBP51 呈高表达，二者与病人预后有关。