叶菌唑的液相色谱手性分离分析方法研究

韦红慧，杨宝萍，韦元杰，李晓昀

(广西速竟科技有限公司，广西南宁 530007)

叶菌唑英文名称：metconazole，CAS号：125116-23-6，分子式：C17H22ClN3O，化学名称：5-(4-氯苯基)-2,2-二甲基-1-(1,2,4-三唑-1-基甲基)-环戊醇[1]。叶菌唑为日本昊羽化学公司于20世纪90年代开发的新型三唑类杀菌剂，是一种兼具内吸、保护及治疗作用的广谱杀菌剂[1]。田间施用对谷物壳针孢、链孢霉和柄锈菌引起的病害有卓越效果，对非靶标生物低毒，用量少，杀菌活性高，对环境安全，具有良好的发展前景[1]。

目前报道叶菌唑的分析方法多为4个异构体未进行拆分的检测方法[1-2]，即使有报道手性分离方法，也不是针对农药产品[3]。基于此，本研究采用液相色谱技术开展了8%叶菌唑悬浮剂及50%叶菌唑水分散粒剂的分析研究以期为该药剂产品质量控制及异构体拆分提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 样品

8%叶菌唑悬浮剂和50%叶菌唑水分散粒剂，由广西田园生化股份有限公司提供。

1.2 试剂和溶液

正己烷，色谱纯；无水乙醇，色谱纯；甲醇，色谱纯；叶菌唑标样：已知质量分数99.8%，德国Dr.Ehrenstorfer公司提供。

1.3 仪器设备

1260高效液相色谱仪，具有二极管阵列检测器、自动进样器和色谱工作站(美国安捷伦公司)；色谱柱：250 mm×4.6 mm (i.d.)不锈钢柱，内装CHIRALCEL OJ-H、5 μm填充物。

1.4 高效液相色谱分析条件

流动相：正己烷+无水乙醇+甲醇=981∶15∶4 (体积比)；速流：1.5 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：220 nm；进样体积：10 μL。在此色谱条件下，叶菌唑的保留时间：1R,5S-叶菌唑约22.6 min，1S, 5R-叶菌唑约24.8 min，1S,5S-叶菌唑约27.4 min，1R,5R-叶菌唑约32.7 min。叶菌唑标样及样品的典型液相色谱图见图1、图2、图3。

1.5 测定步骤

1.5.1 标样溶液的制备

称取50.0 mg (精确至0.1 mg)叶菌唑标样于50 mL容量瓶中，加入20 mL流动相，超声波振荡15 min，冷却至室温，用流动相定容，摇匀。

1.5.2 试样溶液的制备

称取含50.0 mg (精确至0.1 mg)叶菌唑的试样于50 mL容量瓶中，加入20 mL流动相，超声波振荡 15 min，冷却至室温，用流动相定容，摇匀，过滤。

1.5.3 测定

在上述操作条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻2针叶菌唑(4个峰总和)峰面积相对变化小于1.2%后，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

1.5.4 计算

将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中叶菌唑(4个峰总和)峰面积分别进行平均。试样中叶菌唑质量分数ω(%)，按公式(1)计算：

式中：A1为标样溶液中叶菌唑(4个峰总和)峰面积的平均值；A2为试样溶液中叶菌唑(4个峰总和)峰面积的平均值；m1为叶菌唑标样的质量，单位为克(g)；m2为试样的质量，单位为克(g)；ω1为标样中叶菌唑质量分数，以%表示。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

叶菌唑的紫外扫描光谱图如图4所示，从图4可以看到叶菌唑的最大吸收波长约220 nm，在该波长处灵敏度较高，干扰较少，能够满足分析的要求，故将检测波长确定为220 nm。

色谱柱选择常用的CHIRALCEL OJ-H手性正相柱。根据叶菌唑物化性质和溶剂的紫外吸收波长，选择流动相作为溶剂溶解样品。先以正己烷和无水乙醇作为流动相。将流动相按不同比例在色谱柱上进行试验，随着无水乙醇比例的增加，保留时间减小，当正己烷与无水乙醇比例达到985∶15时，叶菌唑无杂质峰干扰，各个叶菌唑异构体能分离，峰纯度达到试验要求，但分析时间很长。故在上述的流动相中加少量的甲醇，并调快流速，在叶菌唑能完全分离的情况下达到减短分析时间的效果。最终选择正己烷+无水乙醇+甲醇=981∶15∶4作为流动相，流速1.5 mL/min。在该条件下，叶菌唑色谱峰峰形较好，与杂质能完全分离，具有良好的精密度和准确度，并且分析时间较短，提高了工作效率。

2.2 特异性试验

本试验采用HPLC-DAD峰纯度分析法来鉴别叶菌唑。叶菌唑标样、8%叶菌唑悬浮剂和50%叶菌唑水分散粒剂中的叶菌唑HPLC-DAD峰纯度均大于990，有效成分处无其他物质干扰，符合定量分析要求。峰纯度色谱图见图5～图7。

2.3 线性关系试验

按1.5.1节分别配制5个不同质量浓度的叶菌唑标样溶液，在相应色谱操作条件下进行分析，以叶菌唑质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(图8)。当叶菌唑质量浓度在208.9～3 025.6 mg/L得到线性方程为y=14.17x-63.09，线性相关系数R=1.00。

2.4 方法精密度试验

按1.5.2节试样溶液的制备方法分别配制5个8%叶菌唑悬浮剂和5个50%水分散粒剂溶液。以线性关系试验中1 009.2 mg/L叶菌唑溶液为标样溶液，在上述操作条件下，待仪器基线稳定后进行测定(表1和表2)。测得的8%悬浮剂和50%水分散粒剂的RSD分别为0.71%和0.41%，分别小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.98和1.50，说明分析方法精密度的结果符合质量控制的基本要求。

表1 8%叶菌唑悬浮剂精密度试验结果

表2 50%叶菌唑水分散粒剂精密度试验结果

2.5 方法准确度试验

称取含25.0 mg (精确至0.1 mg)叶菌唑的8%叶菌唑悬浮剂和50%水分散粒剂各5份，置于50 mL容量瓶中，分别加入叶菌唑标样25.0 mg，按1.5.2节的方法配制有效成分准确度溶液。以线性关系试验中1 009.2 mg/L叶菌唑溶液为标样溶液，计算叶菌唑的回收率(表3和表4)。8%叶菌唑悬浮剂和50%水分散粒剂中叶菌唑平均回收率分别为99%、100%，表明此分析方法具有良好的准确度。

3 结 论

试验结果表明，本文测定叶菌唑所采用的分析方法，在测试浓度范围内线性关系良好，具有较高的准确度和精密度，具有准确及分离效果好的优点，能满足产品的日常检验和质量控制要求，也为对叶菌唑单一异构体定量分析提供了一定的试验依据。

表4 50%叶菌唑水分散粒剂回收率试验结果