白菜基因组导入芥菜的远缘杂交及后代分离偏向性

李祥升，常立春，陈海旭，武 剑，梁建丽，林润茂，郭新磊，高 杰，王晓武

(1.新疆农业大学林学与园艺学院, 乌鲁木齐 830052；2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京 100081)

0 引 言

【研究意义】芥菜(2n=36，BrassicajunceaL.)是十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)植物，包括根用芥菜、茎用芥菜、叶用芥菜和薹用芥菜等[1]。其中，叶用芥菜(Brassicajunceavar.foliosaBailey)中的包心芥菜(Brassicajunceavar.capitataHort)易于栽培、生长周期短，随着酸菜工厂化加工技术不断发展，种植面积逐渐扩大[2-3]。包心芥菜的包心比较松散，结球性差。目前，我国使用的芥菜类品种主要是地方常规品种，品种杂乱[4-5]，HRM技术结合InDel标记分型具有操作简单、灵敏度高、通量大、基因分型准确等优势。开发一套可区分白菜与芥菜的HRM-InDel标记有利于在芥菜杂交育种中实现高通量检测基因型，加速杂交育种进程。【前人研究进展】芥菜由芸薹属的2个二倍体基本种白菜(A基因组)和黑芥(B基因组)通过天然杂交和基因组自然加倍形成，属于异源四倍体(AABB)。目前，芥菜研究主要集中在细胞学、分子生物学和高产栽培与加工等。徐书法等[6]将芥菜与大白菜进行了远缘杂交。Srivastava等[7]通过远缘杂交，采用芜菁和黑芥杂交后人工加倍合成了芥菜型油菜。魏素萍[8]利用蔬菜用芥菜与白菜型油菜杂交，以芥菜为轮回亲本获得了回交一代群体。水稻、玉米、白菜、番茄等作物研究中均已应用InDel标记，并取得了一定的成果[9-12]。Liu等[13]开发了覆盖白菜全基因组的639个InDel标记，并筛选出387个具有多态性性的标记，对大白菜分子标记辅助育种研究积累了标记材料。张志刚等[14-15]基于白菜全基因组测序数据开发并筛选出了593个具有多态性的InDel标记，并筛选出了一批剩余杂合体单株，还获得了20对可基于HRM技术分型的标记。陈荣等[16]基于白菜全基因组测序开发了252个可用于HRM分型的InDel标记，筛选出了148对在结球白菜与不结球白菜中有多态性的标记，优化了HRM分型的技术体系。【本研究切入点】采取传统育种方式选育芥菜新品种较多，将分子标记辅助选择技术应用于芥菜育种中尚不多。目前，基于HRM技术和InDel标记的分子标记辅助技术，在芥菜远缘杂交育种中的应用鲜有报道。研究远缘杂交将结球白菜的A基因组导入包心芥菜。【拟解决的关键问题】运用远缘杂交将结球白菜中控制结球的基因导入芥菜中，采用InDel标记和HRM分型平台，利用分子标记辅助选择的手段，筛选回交过程中保留较多白菜基因的材料，改善包心芥菜的结球性，丰富包心芥菜的种质资源，拓宽分子标记辅助芥菜育种的方法，为芥菜类作物的优异基因资源挖掘、农艺性状改良积累芥菜材料和InDel标记提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

2018年秋季，将6份芥菜亲本和2份白菜亲本材料种植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所南区日光温室，2019年春，以芥菜为母本与白菜杂交获得F1，以包心芥菜作为轮回亲本与获得的F1进行回交，2019年夏秋获得BC1幼苗。2018年秋至2019年春以包心芥菜为轮回亲本，对已有F1材料进行回交收种，2019年春获得BC1幼苗。表1

表1 亲本信息及杂交群体编号Table 1 Parental information and hybrid group number

中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供根据白菜设计的InDel标记。

1.2 方 法

1.2.1 杂交与回交

杂交：2018年秋将亲本播入穴盘，发芽后4℃春化，时间为30 d。春化完成后将穴盘移入温室，幼苗长出4～5片真叶时移入花盆，开花后以包心芥菜为母本(开花前1～3 d的花蕾)，以结球白菜为父本进行杂交获得F1，时间选择在09：00～16：00。

回交：以F1为母本与轮回亲本芥菜回交，花序不去顶，时间09:00～16:00。

结籽率和回交率：共获得9个种间杂种组合。其中，芥菜与结球白菜B9008杂交的组合均获得F1后代，而芥菜与结球白菜Chiifu杂交的组合中，只有3个组合获得F1后代，其余3个组合未能获得杂种一代，统计结籽率。F1种子或幼胚通过幼胚培养技术迅速培养成苗，并以芥菜为轮回亲本进行回交，统计回交结籽率。

1.2.2 幼胚培养

在魏素萍[8]基础上加以改进。取授粉后20～25 d的膨大的未成熟的角果，用清水冲洗干净，用75%的酒精处理种荚1 min，用无菌水洗涤2次，再转入2%的NaClO溶液中消毒3～5 min，然用无菌水洗涤2次。用解剖针和镊子将胚剥离出来，放入蔗糖含量2.6%的B5或MS培养基上。置于25℃，光照12 h的组培间中培养成苗。

1.2.3 F1真实性判定

由于真杂合子代为三倍体，高度不育，观察开花后结实判定F1是否为真杂合子代。

对F1回交时，选用6份芥亲本中的3份作为回交亲本。

1.2.4 DNA提取

采用磁珠法提取亲本及杂交子代叶片基因组DNA。提取的DNA经NanoDrop 1000(Thermo，USA)检测其纯度和浓度，并通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量。将DNA的一部分稀释到20 ng/μL为工作液，剩余的DNA保存在-20°C备用。

1.2.5 PCR扩增和HRM基因分型

PCR扩增和HRM基因分型体系采用实验室已开发的技术体系[16]。PCR反应在384孔PCR板上进行。PCR反应和HRM基因分型在Quant Studio 12K Flex Real-Time仪器上进行，同时用普通PCR仪进行PCR反应，之后在Quant Studio 12K仪器上进行HRM基因分型，以提高标记筛选通量。HRM基因分型完成后，导出实验结果图片和EXCEL数据表。

2 结果与分析

2.1 种间杂种F1及其回交结籽率

研究表明，不同组合的结籽率存在差异。结球白菜B9008作父本时，杂交组合的结籽率为12.50%～78.38%，均值为35.97%，回交结籽率为3.48%～19.28%，均值为8.10%。其中结籽率最高的是YZ17JC189，YZ17JC042次之，与YZ17JC124的结籽率最低。当结球白菜Chiifu作父本时，杂交组合的结籽率为16.28%～48.39%，均值为34.69%，回交结籽率为0～3.52%，均值为2.28%。杂交过程结籽率较B9008作亲本时有所降低，但依旧是与包心芥菜YZ17JC189和YZ17JC042的亲和性较高。组合YZ17JC189×Chiifu未获得BC1群体，回交过程中的结籽率普遍低于杂交过程的结籽率。其中，杂交组合YZ17JC124×B9008在回交时结籽率最高，高出结籽率最低的组合YZ17JC042×B9008近6倍，比远缘杂交时的结籽率高出将近7个百分点，该组合回交时结籽率较高。而杂交组合YZ17JC124×Chiifu回交时结籽率较低。图1

2.2 F1群体回交收种

研究表明，18NP164.jc回交结籽率为1.04%～24.18%，均值为15.77%，18NP173.jc回交结籽率为1.06%～3.23%，均值为2.40%。材料18NP164.jc×YZ17JC042和18NP164.jc×YZ17JC115在未用幼胚培养技术辅助回交的情况下结籽率较高，与材料18NP173.jc相关的回交组合在无幼胚培养辅助的情况下，结籽率普遍低于幼胚培养的材料。排除结籽率较高和最低的组合之后，回交中使用幼胚培养的组合结籽率均值为4.64%，而未使用幼胚培养技术的回交组合结籽率均值为2.40%。图1，图2

2.3 可区分白菜与芥菜的InDel标记筛选结果

研究表明，共选出203个在结球白菜与包心芥菜间具有多态性的InDel标记。其中有49个标记可准确区分供试的8份包心芥菜和7份结球白菜，154个无法将全部供试白菜与芥菜区分开，可以有针对性的使用。可分型标记占总标记的50.62%，可区分所有供试材料的标记占比为12.22%。

2.4 用于BC1群体筛查的引物

研究表明，筛选出的49个可用标记中选出20个分型效果较好的标记，覆盖到每条染色，利用这些标记追踪BC1群体的白菜基因。表2

2.5 标记在回交群体中的InDel分型

研究表明，所有单株均携带白菜基因，单株中白菜标记占比为30%～100%，平均占比为73.80%。绝大部分单株携带的白菜特异标记在50%以上，在回交过程中白菜基因更容易保留。特别是以B9008为白菜亲本的组合XS1255×JC124，不仅单株最多，而且所有单株的标记含量都在50%以上。图3

BC1群体中杂合比例为64.06%～77.49%，均值为71.53%，显著高于理论值50%(P<0.01)，回交时F1中的白菜A基因组和芥菜A基因组并不是按照理论意义上的1∶1传递的，而是保留了较多的白菜基因。图4

根据白菜亲本差异将192棵单株分为8个组，各群体的白菜标记占比均高于50%。最高的是组合LXS1259，白菜标记占比达到了81.67%；白菜亲本为Chiifu的群体中白菜基因占比最低，为51.82%。图5

分组为LXS1254和“其它”的2组有部分标记在群体中的占比低于50%，其余分组中的每个标记在群体中的占比均高于50%。Chiifu为白菜亲本的群体中有9对标记的杂合比例低于50%，最低值为27.27%，最高值为72.73%。以50%为检验值，对8个分组中各个标记的占比进行T检验，除组名为Chiifu的分组外，所有分组的P值均小于0.05，而分组为Chiifu的群体中P=0.56>0.05。在白菜亲本非Chiifu的群体中，白菜标记占比显著高于50%，偏向于白菜基因的传递，不符合回交后代1∶1的分离比；白菜亲本为Chiifu的群体中白菜标记占比与理论值50%无明显差异，符合回交后代1：1的分离比。图6

3 讨 论

远缘杂交普遍存在生殖隔离和后代不育问题，难以通过单纯的有性杂交获得杂种后代。远缘杂交后代育性较低或败育是育种工作中的常见现象，研究回交过程的结籽率普遍低于远缘杂交过程的结实率证实了这一点。而这特点刚好可用于鉴定杂交种，尤其在三倍体F1的杂种鉴定中具有极强的实用性。F1的基因型为AAB，B基因组在减数分裂中多以单价体形式存在，难以进行正常的减数分裂[17]。异源三倍体减数分裂过程中来自亲本的染色体难以正常配对，这也是导致败育的重要原因[18]。但这并不意味着三倍体都无法产生配子，有些物种可以产生非整倍体配子，甚至存在整倍体配子产生，并且能够产生后代[19]。有多个研究通过培养子房或幼胚，均获得了理想材料[20-24]。研究利用幼胚培养技术，在胚珠败育之前或刚发生败育时人工干预，在回交过程中起到了很大作用，筛选出了理想的芥菜与白菜杂交的组合YZ17JC042×B9008、YZ17JC189×B9008、YZ17JC042×Chiifu和YZ17JC189×Chiifu。

幼胚培养技术可提高结籽率。柳霖坡[25]利用幼胚培养技术将四倍体甘蓝与二倍体甘蓝杂交结籽率从3.79%提高到了53.33%。研究发现未使用幼胚培养技术的组合，其回交结籽率普遍较低。回交中使用幼胚培养的组合结籽率均值为4.64%，而未使用幼胚培养技术的回交组合结籽率均值为2.40%。但在远缘杂交过程中有的组合因为生殖隔离严重，没有获得杂种后代，并且获得杂交后代的组合亲和性也各不相同。

偏分离是生物界广泛存在的现象，指的是分离群体基因分型比不遵循孟德尔分离规律[26]。随着分子标记技术的发展，多种作物的遗传图谱相继构建出来。在玉米、水稻、小麦、棉花、南瓜和白菜等作物中均发现了大量的偏分离位点[27-32]。但前人的研究多是利用品种间或亚种杂交分离后代绘制遗传图谱，且仅部分标记位点存在偏分离现象。研究发现，所有白菜标记位点在回交群体中均偏向于保留白菜基因。研究结果显示，各标记在全部BC1单株的杂合比例为64.06%～77.49%，均高于理论上的50%，以50%为检测值，显著性检验结果显示P<0.01，差异显著，明显偏向于传递白菜基因。除白菜亲本为Chiifu的群体外，各群体均明显偏向于传递白菜基因，来自于白菜A基因组的基因在杂交群体中传递的概率超过了芥菜A基因组。偏分离与杂种群体的亲本有一定关系，Chiifu群体虽无显著偏分离现象，但分离群体杂合比例为51.82%，如群体单株数量足够多亦有出现显著偏分离的。这种远缘杂交偏向保留白菜基因的分离现象对研究是有利的，偏分离被认为是作物进化的一种重要动力[33]。研究中偏分离现象的产生或与配子或合子的选择有关[34]，在配子或合子形成的过程中，包含白菜基因较多的配子或合子被保留了下来，而包含白菜基因少的配子或合子选择性凋亡，这和Xu等[35]认为雄配子体选择性保留的结果一致。但与前人研究不同的是，研究中的所有标记均存在偏分离现象，这一对远缘杂交工作有利的现象值得关注。

4 结 论

4.1材料YZ17JC189只在与白菜亲本B9008组合时，后代与芥菜回交结籽率较高，与其它白菜组合时回交结籽率均较低，回交结籽率与白菜亲本有关。在利用白菜A基因组进行芥菜资源创制过程中，最好选择多个同类型不同材料作为亲本，以便从中选择出结籽率较高的回交组合。

4.2远缘杂交结合幼胚培养获得了9个种间杂种组合和14个BC1群体。筛选出了芥菜与白菜远缘杂交结籽率高的4个组合YZ17JC042×B9008、YZ17JC189×B9008、YZ17JC042×Chiifu和YZ17JC189×Chiifu；并筛选出了3个回交结籽率高的理想组合18NP164.jc×042、18NP164.jc×115和XS1256×YZ17JC124(YZ17JC124×B9008)。证实了三倍体高度不育性在芸薹属间杂种鉴定中的实用性，三倍体杂种育性较低，回交一代BC1比杂种一代F1更难获得。以结球白菜B9008作父本的组合为例，杂交过程的结籽率均值为35.97%，而回交过程结籽率8.10%。发现了幼胚培养技术辅助回交可有效提高结籽率。回交过程中利用幼胚培养的组合结籽率均值为4.72%，而未使用幼胚培养技术的回交组合结籽率均值为2.9%。

4.3在回交群体中存在明显偏分离现象，偏向于传递白菜基因。利用20个InDel标记追踪192株BC1单株的白菜基因，各标记在全部BC1单株的杂合比例为64.06%～77.49%，均高于理论上的50%，以50%为检测值，P<0.01，差异显著，明显偏向于传递白菜基因。有一半单株的标记占比在78.3%以上，有54棵单株标记占比超过90%。