噻虫嗪种子包衣棉花对棉蚜和棉长管蚜解毒酶活性的影响

麻正辉，苏 悦，马 雪，羊 河，侯国辉，陈柄润，韩 旭，姚永生

(塔里木大学植物科学学院/南疆农业有害生物综合治理兵团重点实验室，新疆阿拉尔 843300)

0 引 言

【研究意义】棉蚜(Aphisgossypii)和棉长管蚜(Acyrthosiphomgossypii)在新疆植棉区共存发生[1]，棉蚜取食造成叶片皱缩、植株矮化，又分泌蜜露引发霉菌危害，影响棉花产量和品质，棉长管蚜无群集习性，田间种群密度相对较低，对棉花一般不构成为害影响。棉长管蚜是棉花苗期发生的优势种，棉蚜为棉花现蕾期后的优势种，利用棉田早期的棉长管蚜培养天敌，可有效抑制棉花中后期棉蚜的发生与为害[2-6]。棉蚜在棉花苗期发生为害，已成为棉花整个生育期的蚜虫优势种群和新疆棉田的主要防治对象，杀虫剂施用剂量和频率越来越高[7]。新烟碱类杀虫剂噻虫嗪是棉田常用农药，分析噻虫嗪包衣对棉蚜和棉长管蚜解毒酶活性的影响，对研究棉田害虫演替和蚜虫综合治理具有重要意义。【前人研究进展】乙酰胆碱酯酶(AChE)、羧酸酯酶(CarE)、细胞色素P450(CYP450)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)是昆虫克服毒害物质的重要酶系，在昆虫体内能够参与或帮助代谢分解毒害物质，使昆虫对农药产生抗性[8-9]。研究表明，AChE在棉蚜对有机磷、氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性中发挥主导作用[10]，CarE表达量的增加与棉蚜对有机磷抗性的增强有关[11]。武永强等[12]研究结果表明，CYP450是棉蚜对噻虫嗪产生抗性的主要因素，Wei等[13]也认为棉蚜对噻虫嗪产生抗性是CYP450与酯酶的共同作用。药剂处理昆虫后CarE活性显著上升[14,15]。噻虫嗪抑制昆虫烟碱型乙酰胆碱受体使昆虫瘫痪死亡，既可以叶面喷雾，也可以用于种子处理，对棉花苗期蚜虫有较好的防效[16,17]。【本研究切入点】取食噻虫嗪包衣处理棉花后，棉蚜和棉长管蚜解毒酶活性的变化未见报道。测定棉蚜和棉长管蚜取食噻虫嗪包衣棉花后解毒酶活性变化。【拟解决的关键问题】使用2、4 g/kg噻虫嗪包衣棉花，三叶期时采用生化方法测定取食0、2、6、12、24 h后棉蚜和棉长管蚜体内解毒酶的活性变化，分析棉蚜和棉长管蚜对药剂包衣棉花的适应能力，为防控棉田蚜虫危害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试虫源

棉蚜、棉长管蚜均采自新疆生产建设兵团第一师12团11连试验田(E 81°33'，N 40°48')，于室内人工气候箱(RTOP-260Y)用棉苗连续饲养2～3代作为虫源，棉花品种为新陆中68号，饲养饲养温度(23±1)℃，相对湿度60%±10%，光周期L∶D=14∶10。

棉种包衣剂量设0(CK)、2和4 g/kg 3种处理，种子包衣后于阴凉通风处自然阴干封存。2020年4月10日于塔里木大学农学试验站覆膜直播，品种为新陆中78号。

1.1.2 供试药剂及主要仪器

70%噻虫嗪种子处理可分散粉剂，瑞士先正达作物保护有限公司；羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、乙酰胆碱酯酶(AChE)和细胞色素P450(CYP450)及BCA蛋白定量试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。SCIENTZ-48型高通量组织研磨器(宁波新芝科技股份有限公司)；Fresco 21微量冷冻离心机和Multiskan FC型酶标仪(赛默飞世尔仪器有限公司)。

1.2 方 法

待棉花长至三叶期，选取长势健康的棉株清理，挑选大小一致的健康成蚜饥饿2 h后，进行接种试验，试验期间用笼网(30×30×50(cm)，200目纱网)笼罩。

分别于接种前(记作0 h)及接种后2、6、12、24 h，在受试棉蚜和棉长管蚜中各挑选20头无翅成虫，加入1 mL PBS(0.066 mol/L、pH 7.4)冰浴匀浆后离心(4℃，1 200 g，30 min)，取上清得到酶粗提液。离心参数：AchE、CarE(4℃，1 500 g，30 min)；CYP450、GSTs(4℃，10 000 g，20 min)；测定参照试剂盒，根据制作的标准曲线和酶原蛋白含量的测定结果，计算酶比活力。

1.3 数据处理

采用SPSS 25数据处理，差异显著性分析使用Duncan氏多重比较法；绘图使用Origin 2018。

2 结果与分析

2.1 棉蚜取食噻虫嗪包衣棉花后解毒酶活性变化

2.1.1 棉蚜取食噻虫嗪包衣棉花后AChE活性变化

研究表明，2 g/kg剂量处理后AChE活性在2 h时增加9.20%，随后在6、12、24 h分别降低9.10%、28.23%、33.79%，除24 h外，各时间点较前一时间点活性降低水平均显著。4 g/kg剂量处理后2、6、12、24 h分别降低34.01%、51.82%、63.48%、64.68%。2 g/kg剂量处理后2 h活性高于CK，其余各时间点均低于CK且高于4 g/kg处理。棉蚜取食噻虫嗪包衣棉花后，低剂量2 h(短时)对AChE活性有显著的诱导作用，但随时间增加表现为抑制作用，而4 g/kg剂量处理后活性持续降低。图1

注：不同小写字母表示棉蚜解毒酶活性差异显著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicated that the detoxification enzyme activity of Aphis gossypii was significantly different(P <0.05),the same as below图1 不同噻虫嗪包衣棉花下棉蚜AChE活性变化Fig.1 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on AChE of Aphis gossypii

2.1.2 棉蚜取食噻虫嗪包衣棉花后CarE活性变化

研究表明，棉蚜取食噻虫嗪包衣棉花后，2 g/kg剂量处理活性先上升后下降，12 h时显著高于其它时间点，并高于CK，24 h较12 h降低43.02%。4 g/kg剂量处理后持续下降，在不同时间点分别下降18.41%、29.26%、42.43%、53.01%，且始终低于CK。图2

图2 不同噻虫嗪包衣棉花下棉蚜CarE活性变化Fig.2 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on CarE of Aphis gossypii

2.1.3 棉蚜取食噻虫嗪包衣棉花后CYP450活性变化

研究表明，棉蚜CYP450活性的影响随时间增加最终表现为低剂量的诱导作用和高剂量的显著抑制作用。4 g/kg处理在0 h时活性最大，2 h时活性显著下降，随着时间的继续增加略有波动，但不同时间点间无显著关系。2 g/kg处理在2 h、6 h较0 h活性分别提高20.35%、31.48%，各时间点间差异显著，随后下降，但仍显著高于0 h。图3

图3 不同噻虫嗪包衣棉花下棉蚜CYP450活性变化Fig.3 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on CYP450 of Aphis gossypii

2.1.4 棉蚜取食噻虫嗪包衣棉花后GSTs活性变化

研究表明，棉蚜取食噻虫嗪包衣棉花后，低剂量6 h对GSTs有显著的持续诱导作用，高剂量则为显著的持续抑制作用。2 g/kg剂量处理6 h内活性显著持续上升，较0 h、2 h分别增加17.35%、30.09%，随后活性显著下降，较6 h分别降低23.99%、51.77%。4 g/kg处后，随着时间增加活性显著下降，较0 h分别降低10.96%、29.40%、39.49%、47.74%。图4

图4 不同噻虫嗪包衣棉花下棉蚜GSTs活性变化Fig.4 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on GSTs of Aphis gossypii

2.2 棉长管蚜取食噻虫嗪包衣棉花后解毒酶活性变化

2.2.1 棉长管蚜取食噻虫嗪包衣棉花后AChE活性变化

研究表明，棉长管蚜取食噻虫嗪包衣棉花后，2和4 g/kg处理AChE活性均表现为持续下降，在2 h时，2 g/kg处理高出CK 2.97%，其它时间均低于CK。4 g/kg处理在2～24 h各时间点活性分别下降31.60%、46.38%、51.41%、59.41%，与其它处理相比活性始终最低。图5

图5 不同噻虫嗪包衣棉花下棉长管蚜AChE活性变化Fig.5 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on AChE of Acyrthosiphon gossypii

2.2.2 棉长管蚜取食噻虫嗪包衣棉花后CarE活性变化

研究表明，棉长管蚜取食噻虫嗪包衣处理棉花后，低剂量短时(6 h)对CarE活性有显著诱导作用，高剂量则为持续抑制作用。噻虫嗪2 g/kg处理在2 h、6 h分别较0 h提高25.77%、42.95%，随后在12 h、24 h较6 h降低25.46%、51.53%。4 g/kg在6、12、24 h较2 h分别下降20.85%、29.52%、40.39%，且各时间点间差异显著。图6

图6 不同噻虫嗪包衣棉花下棉长管蚜CarE活性变化Fig.6 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on CarE of Acyrthosiphon gossypii

2.2.3 棉长管蚜取食噻虫嗪包衣棉花后CYP450活性变化

研究表明，棉长管蚜取食噻虫嗪包衣棉花后，2 g/kg处理活性在2 h达到最大，较0 h显著提升7.45%，其它时间点间无显著变化。4 g/kg处理活性在6 h达到最大，较2 h提高10.37%，2处理12～24 h对CYP450活性均无明显影响。图7

图7 不同噻虫嗪包衣棉花下棉长管蚜CYP450活性变化Fig.7 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on CYP450 of Acyrthosiphon gossypii

2.2.4 棉长管蚜取食噻虫嗪包衣棉花后GSTs活性变化

研究表明，棉长管蚜取食噻虫嗪包衣处理棉花后，2 g/kg处理GSTs活性先升后降，12 h内各时间点无显著差异，24 h较0 h降低61.86%，且显著低于其它时间点。4 g/kg处理活性持续降低，2～24 h内各时间点较0 h分别下降30.10%、41.41%、49.72%、61.87%，各处理间均有显著差异。低剂量处理对GSTs活性短时(6 h)呈现有诱导作用，高剂量处理有持续抑制作用。图8

图8 不同噻虫嗪包衣棉花下棉长管蚜GSTs活性变化Fig.8 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on GSTs of Acyrthosiphon gossypii

2.3 棉蚜和棉长管蚜取食噻虫嗪包衣棉花后解毒酶活性变化

研究表明，棉蚜体内各解毒酶活性均高于棉长管蚜，且在取食噻虫嗪包衣棉花后上升速度也高于棉长管蚜。在取食噻虫嗪包衣处理棉花植株的叶片前，棉蚜AChE、CarE、CYP450、GSTs的相对活力分别为棉长管蚜的4.62、2.51、1.08、1.51倍，除CYP450外，棉蚜解毒酶的相对活力均显著高于棉长管蚜(P<0.05)。AChE相对酶活比在取食2 g/kg处理2 h内激增，随后随时间逐渐下降，最终接近CK的相对酶活比，而4 g/kg处理相对酶活比除在6 h有所下降外，其余时间均呈上升趋势。2 和4 g/kg处理CarE相对酶活比在2 h均有所下降，4 g/kg处理随后开始上升并趋于稳定，而2 g/kg处理在6～12 h激增，随后下降，并在24 h高于其它处理。棉蚜和棉长管蚜的CYP450相对酶活在取食前接近，取食4 g/kg处理后下降，24 h时小于1.00，取食2 g/kg处理6 h内两者相对酶活比呈上升趋势，随后小幅下降，两者存在显著差异(P<0.05)。2 g/kg处理下2种蚜虫的GSTs相对酶活比先上升后下降，而4 g/kg处理下，不同时间点相对酶活比高于2 g/kg及CK处理，且整体呈持续上升趋势。图9

注：相对酶活比=棉蚜比活力/棉长管蚜比活力Note：Relative ratio=Activity of Aphis gossypii/Activity of Acyrthosiphon gossypii图9 棉蚜和棉长管蚜的相对酶活比变化Fig.9 Change of relative ratio between Aphis gossypii and Acyrthosiphon gossypii

3 讨 论

乙酰胆碱酯酶(AChE)通过催化降解神经递质乙酰胆碱，终止其对神经突触后膜兴奋的刺激作用，以维持神经冲动在生物体内的正常传递[18]。试验结果表明，取食噻虫嗪包衣棉花叶片后，低剂量处理时，棉蚜AChE活性呈现出时间效应，但对照处理棉蚜AChE活性有显著上升，因此，推测这种现象可能是由棉蚜取食棉叶带来的诱导效应，这种现象与曾贤义[19]用吡虫啉处理烟蚜，曾春祥等[20]用吡虫啉处理桃蚜后，两者AChE表现出结果一致。两者的AChE活力比在取食不同剂量处理24 h后均有所上升，相同剂量噻虫嗪包衣棉花后棉蚜的AChE活性更高，尤其是在高剂量下两者酶活比的增加幅度更大，而在预试验中，棉蚜也表现出了对高剂量更好的耐受性。虽然明确噻虫嗪作用靶标为乙酰胆碱受体[21,22]，但高剂量处理和棉长管蚜取食后均表现出明显的抑制作用。

羧酸酯酶(CarE)可将含酯键、酰胺键、硫酯键等的外源物质水解为相应的醇或酸[23]。此次试验中噻虫嗪低剂量处理短时对试虫的CarE活性有持续的诱导作用，高剂量处理为显著的持续抑制作用，在24 h均表现为显著的抑制作用。石绪根[24]经研究发现，抗性棉蚜品系体内的CarE表达量增加较小，与试验中棉蚜和棉长管蚜在被处理后CarE活力比的变化结果相佐证。吕敏等[25]通过研究发现植物次生物质2-十三烷酮和槲皮素对棉蚜CarE分别具有显著的诱导作用和剂量效应，实验中棉蚜对照组CarE活力也出现了时间上的显著波动，并在24 h时呈现出显著的提高。噻虫嗪种子包衣棉花对蚜虫CarE的影响是多方面综合的复杂结果，且受到时间和剂量的影响。

细胞色素P450(CYP450)是生命体药物代谢过程中的主要蛋白酶，因酶蛋白中血红素与CO结合在可见光450 nm处有最大吸收峰而得名[26]。试验中棉蚜取食高剂量、棉长管蚜取食不同剂量噻虫嗪包衣处理植株的棉叶CYP450活力变化较小，各处理组内不同时间点多数差异不显著。有报道[27,28]通过测定酶抑制剂增效作用，发现增效醚对新烟碱类药剂具有显著的增效作用，说明CYP450在昆虫在对新烟碱类药剂产生抗性的过程中发挥了显著的作用，试验中棉蚜取食低剂量处理后体内CYP450活性得到了显著的升高，两者结论一致。另有研究表明，CYP450帮助昆虫外源毒害物质的代谢主要是通过部分有关蜕皮激素合成基因的过表达实现的[24]，而试验中选取的棉蚜均为成蚜，体内蜕皮激素含量低，可能使噻虫嗪对CYP450的诱导作用有所降低。

谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)是昆虫体内参与有毒物质代谢的一类重要酶。试验中蚜虫取食低剂量噻虫嗪包衣棉花对GSTs活性表现出先诱导后抑制的时间效应，这与袁家瑜等[29]用噻虫嗪亚致死剂量处理月季长管蚜Macrosiphumroswomm表现出的时间效应一致。与王小强等[30]用吡虫啉亚致死剂量处理豌豆蚜Acyrthosiphonpisum24 h内的变化也相吻合。但与对照组相比，诱导效应并不显著。此次试验高剂量处理下2种蚜虫均表现出持续的抑制作用，并且棉蚜在高剂量处理下GSTs的活力在不同时间点均高于棉长管蚜，且两者的比值在不断上升。史晓斌等[26]报道吡虫啉抗性为42.19倍的棉蚜体内GSTs活力是敏感棉蚜的1.58倍，在棉蚜对吡虫啉的抗性产生中，GSTs的活力有所升高，但较为缓慢，与试验中低剂量处理对GSTs的影响相同。GSTs可能参与棉蚜和棉长管蚜取食噻虫嗪包衣棉花后的代谢解毒，但不是主导因素。

与通过亚致死剂量处理后测定昆虫体内酶活力不同，试验中的蚜虫在进行生测前不断取食会持续吸收毒害物质。在这个过程中，对蚜虫产生胁迫的不仅有噻虫嗪，还有棉花体内的抗虫物质，以及噻虫嗪在植物体内的代谢物质和棉花被噻虫嗪诱导产生的化学物质，这些物质都会影响昆虫体内酶的活性。明确噻虫嗪包衣棉花对棉蚜和棉长管蚜解毒酶的影响，对生产中推广新烟碱类药剂种子处理棉种防治棉花蚜虫具有一定的指导作用。

4 结 论

取食噻虫嗪包衣棉花三叶期叶片，2 g/kg处理对棉蚜体内CarE、CYP450、GSTs及棉长管蚜体内CarE、CYP450的活性呈现先抑制后诱导的时间效应。4 g/kg处理对2种蚜虫各解毒酶活性均表现出持续的抑制作用。田间同一地块采集蚜虫经实验室筛选3代后棉蚜AChE、CarE、CYP450、GSTs的相对活力分别为棉长管蚜的4.62、2.51、1.08、1.51倍，棉田棉蚜较棉长管蚜对毒害物质具有较强的代谢能力。