载锰卟啉/紫杉醇的相变纳米粒多模态成像及靶向治疗肿瘤的体外实验研究

张 奕 罗远利 刘 当 曹 阳 冉海涛 杨 超

恶性肿瘤是世界范围内的主要公共卫生问题，也是我国人民最主要的死亡原因之一［1］。传统的肿瘤治疗方式包括手术、化疗和放疗［2］。紫杉醇（PTX）是一种微管稳定剂，作为一线化疗药物主要用于治疗乳腺癌等多种恶性肿瘤。近年来，光动力方法、光热疗法及声动力疗法（SDT）等非侵入性疗法得到了临床广泛关注。其中SDT可以突破光激活的深度限制，在临床应用上具有光动力疗法无法比拟的优势［3］，是一种可靠的治疗方式。本实验以聚乳酸-羟基乙醇酸（PLGA）为载体，制备包裹全氟戊烷（PFP）、四对氯代苯基卟啉锰（MnTTP）及PTX的纳米粒（PFP-MnTTPPTX@PLGA，以下简称FMP@P），并评估其体外光声、超声、磁共振多模态成像能力及其与SDT联合化疗肿瘤的效果。

材料与方法

一、主要实验材料及仪器

1.实验细胞：乳腺癌4T1细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）。

2.主要试剂：PLGA（PLGA-COOH聚合比50∶50，济南岱罡生物科技有限公司）；聚乙烯醇（PVA，美国Sigma公司）；PFP（百灵威科技有限公司）；PTX（上海源叶生物科技有限公司）；MnTTP（上海麦克林生化科技有限公司）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，上海碧云天生物技术有限公司）；2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA，美国Sigma公司）；CCK-8试剂盒、Annexin V FITC/PI（日本同仁化学研究所）。

3.主要仪器：声振仪（VCX130，美国Sonic公司）；超声理疗仪（重庆海扶技术有限公司）；纳米粒径电位分析仪（Zetasizer Nano ZS90，英国Malvern仪器公司）；透射电子显微镜（Hitachi-7500，日本Hitachi公司）；紫外-可见光分光光度计（UV2600 UV-VIS，日本岛津公司）；荧光分光光度计（RF-5301pc）和光声成像系统（Vevo LAZR）均购自加拿大Visual Sonics公司；核磁共振扫描仪（Magnetom Skyra 3.0 T，德国Siemens公司）；彩色多普勒超声诊断仪（MyLab 90，意大利百胜公司）；激光扫描共聚焦显微镜（日本Nikon公司）。

二、FMP@P纳米粒的制备

首先称取10 mg PTX溶解于200μl双蒸水，加入200μl PFP，在冰浴下进行第一步乳化（功率100 W，总时长6 min，工作模式为开启5 s，暂停5 s）得到水相。然后称取50 mg PLGA、2 mg MnTTP溶于3 ml二氯甲烷得到油相，常温振荡使其完全溶解，将水相加入油相中，冰浴条件下使用声振仪声振3 min（功率65 W），再加入8 ml 4%PVA溶液声振2 min（功率33 W），最后加入10 ml 2%异丙醇溶液。避光冰浴条件下低速搅拌3 h使二氯甲烷完全挥发。最后双蒸水洗涤并低温离心（10 000 g，4℃，5 min）2次后获得FMP@P，于4℃条件下保存。其他纳米粒如载PFP、MnTTP的PLGA纳米粒（PFP-MnTTP-PLGA，以下简称FM@P）、载PFP、PTX的PLGA纳米粒（PFP-PTX-PLGA，简称FP@P）等在制备过程中仅加入纳米粒所含的药物，制备方法同FMP@P。

三、FMP@P基本性能检测

使用透射电镜、扫描电镜观察纳米粒的形态，纳米粒径电位分析仪检测纳米粒的粒径及表面电位。以N，N-二甲基甲酰胺（DMF）为溶剂配制不同浓度（1、2、3、4、5μg/ml）的MnTTP-PTX溶液，使用紫外-可见光分光光度计检测吸光度并绘制标准曲线，通过标准曲线计算其包封率。采用高效液相法测定PTX的包封率及超声辐照后FMP@P的药物释放能力。使用单线态氧荧光探针（SOSG）检测低功率聚焦超声（3.0 W/cm2）辐照时间对MnTTP-PTX-PLGA（以下简称MP-PLGA）纳米粒（5μg/ml）单态氧产量的影响。

四、体外超声、光声、磁共振成像实验

1.体外超声成像：以琼脂糖凝胶为原料制作带孔凝胶模型，将FMP@P溶液（2 mg/ml）置于5块琼脂凝胶模型中，使用低功率聚焦超声（3.0 W/cm2）分别辐照1、2、3、4、5 min，然后使用超声诊断仪的B模式和造影模式观察并采集图像（LZ-250探头，频率21 MHz；二维超声增益18.0 dB，超声造影增益35.0 dB）。

2.体外光声成像：以琼脂糖凝胶为原料制作带孔凝胶模型，配制浓度分别为1、2、3、4、5 mg/ml的FMP@P溶液，各取100μl加入不同的凝胶孔内，另取一孔加入100μl双蒸水作为对照。应用光声成像系统观察其成像情况。

3.体外磁共振成像：配制浓度分别为1、2、3、4、5 mg/ml的FMP@P溶液置于EP管中，选用T1_FLAR序列（TR=200，TE=2.5）进行扫描，观测其成像情况及信号强度。

五、体外活性氧检测

将体外培养的对数期乳腺癌4T1细胞，以每孔1×105接种于激光共聚焦培养皿及12孔板中，将细胞分为7组（以共聚焦显微镜观察为例）：①FMP@P+US组，每 孔加入1 ml FMP@P溶液（2 mg/ml），培养4 h后，PBS洗涤3次，加入DCFH-DA溶剂在培养箱内孵育20 min，再用PBS洗涤3次，行低功率聚焦超声（3.0 W/cm2）辐照1 min后，于共聚焦显微镜下观察活性氧生成情况；②FM@P+US组，每孔加入1 ml FM@P（2 mg/ml），其余步骤同FMP@P+US组；③FP@P+US组，每孔加入1 ml FP@P（2 mg/ml），其 余 步骤同FMP@P+US组；④FP@P组，除不用超声辐照外，其余步骤同FP@P+US组；⑤FM@P组，除不用超声辐照外，其余步骤同FM@P+US组；⑥US组，除不加纳米粒进行孵育外，其余步骤同FMP@P+US组；⑦对照组（control组），细胞孔板内不加任何纳米粒，亦不进行超声辐照，DCFHDA染色后直接进行观察。在12孔板中重复上述操作，并用胰酶消化细胞后离心，300μl PBS重悬细胞，使用流式细胞仪检测各组产生活性氧水平。

六、体外联合化疗实验

取对数期乳腺癌4T1细胞，以每孔1×104接种于96孔板内，将细胞分为7组：①FMP@P+US组，在96孔板内加入100μl FMP@P（2 mg/ml）孵育3 h后用PBS进行洗涤，然后使用低功率聚焦超声（3.0 W/cm2）辐照1 min，30 min后加入CCK-8试剂（每孔10μl），孵育1 h后使用酶标仪检测吸光度；②FM@P+US组，每孔加入100μl FM@P，其余步骤同FMP@P+US组；③FP@P+US组，每孔加入100μl FP@P，其余步骤同FMP@P+US组；④FP@P组，除不用超声辐照外，其余步骤同FP@P+US组；⑤FM@P组，除不用超声辐照外，其余步骤同FM@P+US组；⑥US组，除不加纳米粒进行孵育外，其余步骤同FMP@P+US组；⑦对照组（control组），细胞孔板内不加任何纳米粒，亦不用超声辐照，其余步骤同FMP@P+US组。然后以每孔1×105接种于12孔板内，将CCK-8试剂替换为Annexin V FITC/PI（0.1%）重复各组上述操作，并用胰酶消化细胞后离心，300μl PBS重悬细胞，使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

七、统计学处理

应用SPSS 26.0统计软件，计量资料以±s表示，组间两两比较行t检验。相关性分析采用Origin的线性回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、FMP@P的基本表征

FMP@P乳液呈墨绿色，纳米粒为均一的球形（图1A、B）；平均粒径为（323.1±68.3）nm，平均表面电位为（-14.5±8.3）mV。MnTTP-PTX在437 nm最大吸收波长处（图1C），浓度与吸光度具有良好的线性关系，其 包封率 为（93.55±0.46）%。荧 光 探针测 得FMP@P随超声辐照时间延长其荧光强度增强，单态氧产量增加。高效液相法测得PTX的包封率为（81.23±6.93）%。药物释放实验结果显示FMP@P在超声辐照后24 h PTX的累计释放率为31.57%。

图1 FMP@P的基本表征

二、体外光声、超声、磁共振多模态成像结果

体外超声成像显示，B模式及造影模式均可观察到FMP@P增强显像效果，回声强度随辐照时间的增加逐渐增强，分别为17.32、36.73、69.52、86.43、131.25 a.u.和6.45、17.35、28.38、52.56、93.78 a.u.。体外光声成像显示，光声信号强度随FMP@P浓度的增加而增强，分别为0.675、0.837、1.278、1.784、2.097 a.u.，两者在690 nm波长处存在良好的线性关系。体外磁共振成像显示，FMP@P具有增强T1-MR成像的能力，且磁共振信号强度与FMP@P浓度间存在良好的线性关系，随着FMP@P浓度的增加，磁共振信号强度分别为371.91、422.59、452.02、553.50、787.55 a.u.。见图2。

图2 FMP@P的体外超声、光声、磁共振多模态成像

三、体外活性氧检测

FMP@P+US组和FM@P+US组均有大量活性氧产生，且产生的量相当，其余各组无明显活性氧产生（图3）。

图3 各组4T1细胞内活性氧产量的共聚焦显微镜图

四、体外联合化疗效果

CCK-8检查提示：US组、FM@P组、FP@P组、FM@P+US组、FP@P+US组、FMP@P+US组细胞存活率 分别为（95.62±11.13）%、（85.08±7.57）%、（65.40±14.67）%、（43.00±12.30）%、（61.04±9.52）%、（17.74±4.91）%；FMP@P+US组存活率最低，与其余各组比较差异均有统计学意义（均P<0.05）。流式细胞术检测结果与CCK-8相符。

讨 论

化疗是恶性肿瘤传统治疗方法之一，但常伴随难以避免的毒副作用。化疗联合新型治疗方式有望提高肿瘤的治疗效率［4］。SDT是一种新型无创的肿瘤治疗方法，基于超声波组织穿透性强，可以有效作用于深部肿瘤，较光动力疗法、光热疗法等具有更广阔的应用前景［5］。研究［3］表明，微/纳米颗粒可以有效提高SDT效果，PLGA是经美国食品药品监督管理局批准的可生物降解聚合物，能够形成稳定的纳米颗粒，在实验研究中广泛应用。光声成像、磁共振成像是高灵敏度的技术，可以提供高对比度、高空间分辨率的图像［6］；超声成像是一种可指导SDT的无创实时成像技术［7-11］。本实验通过制备FMP@P，旨在评估其体外光声、超声、磁共振多模态成像能力及其与SDT联合化疗肿瘤的效果。

本实验采用双乳化法成功制备FMP@P，其纳米粒呈大小均一的球形。MnTTP为非水溶性声敏剂，而制备成FMP@P后克服了其不溶于水的局限，并提高了生物相容性，可更好地递送药物。此外，本实验利用超声波辐照致使FMP@P纳米粒核心的PFP发生液气相变，纳米粒膨胀直至破裂进而释放内部的药物。体外药物释放实验发现，当纳米粒接受超声辐照后，PTX的释放率明显增加，表明超声波能够激发FMP@P药物的释放。SOSG对单态氧具有高选择性，与单态氧反应后由弱蓝色荧光变为绿色荧光（此特性为试剂本身具有的特征，绿色荧光仅能从波谱看出530 nm波长对应绿色荧光）；其与MP-PLGA的混合溶液随着超声辐照时间的延长，在530 nm波长处的吸收强度增加，表明MP-PLGA具有良好的单态氧生成能力及在SDT中的抗肿瘤潜力。

在体外超声成像实验中，FMP@P溶液随着超声辐照时间的增加，其回声强度逐渐加强。分析其原因，超声辐照后纳米粒核心的PFP发生了液气相转变，纳米微球变成了微米级的微气泡，故能够进行超声成像，而在进一步膨胀后发生爆破，释放药物。卟啉及其衍生物的大π共轭结构使得其具有特殊的光、电等性能，具有良好的光吸收性能，能进行光声成像［12］。在体外光声成像实验中，光声信号强度随FMP@P浓度增加呈线性增强，说明FMP@NPs具有良好的光声成像性能。由于稳定的螯合作用，金属卟啉降低了可导致纤维化或神经毒性的金属转移风险。Mn（Ⅱ）携带5个未配对电子，Gd（Ⅲ）携带7个未配对电子，通常用于T1加权MR造影成像［13］。体外磁共振成像实验表明，FMP@P溶液的T1信号随浓度的增加而增强，且呈良好的线性关系，证明了FMP@P作为磁共振造影剂的潜力。

DCFH-DA是一种氧化应激指示剂，本身无荧光，在进入细胞后可以与活性氧反应生成强荧光的2’，7’-二氯荧光素且荧光信号强度与活性氧水平成正比。本实验结果显示，PTX、PFP或超声均只能导致少量的活性氧产生，而MnTPP经超声辐照后可以产生大量活性氧，表明其可作为声敏剂进行SDT。为验证SDT效果，本研究采用CCK-8法检测7个分组乳腺癌细胞的存活率，结果显示US组、FM@P组细胞存活率均在85%以上，表明单纯超声或FM@P对细胞基本无影响；FM@P+US组、FP@P组细胞存活率明显下降，表明单纯SDT或单纯化疗均有杀伤肿瘤细胞作用；FMP@P+US组细胞存活率最低，与其余各组比较差异均有统计学意义（均P<0.05）。表明联合化疗对肿瘤细胞杀伤效果明显高于单一治疗，流式细胞术结果与CCK-8检测结果相符。

综上所述，本实验成功制备了载MnTTP及PTX的多功能纳米粒FMP@P，可用于体外超声、光声、磁共振成像，并具有良好的SDT联合化疗效果，为后期的体内研究奠定的基础。但本实验仅探讨了FMP@P在体外的相变能力，以及在固定功率下辐照不同时间的相变能力，未探索大功率条件下的相变情况。