高效液相色谱法同时测定姜天麻饮片中天麻素和对羟基苯甲醇含量

唐庆，杨德泉，佘永红

湘西土家族苗族自治州食品药品检验所，湖南 吉首 416000

天麻为兰科植物天麻的干燥块茎［1］。生品味甘，性平。归肝经。功能与主治为：息风止痉、平抑肝阳、祛风通络。用于小儿惊风，癫痫抽搐，破伤风，头痛眩晕，手足不遂，肢体麻木，风湿痹痛。天麻化学成分主要有酚类、有机酸类及植物中常见的甾醇类，其有效成分为天麻素、对羟基苯甲醇等酚类成分［2-3］。天麻素又名天麻苷，是天麻块茎中一种含量最高的有效单体成分，其化学名为4-羟甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，在结构上由4-羟基苯甲醇和葡萄糖两种单体组成，经苦杏仁酶水解后得到对羟基苯甲醇和葡萄糖两种单体［4］。现代药理学显示二者在失眠、惊厥、抑郁、缺血性脑卒中、焦虑、认知障碍等中枢神经系统疾病方面有显著疗效，并且发现该类疾病与神经递质、细胞因子等密切相关［5］，天麻中对羟基苯甲醇在体内、体外均具有显著的抗血小板聚集活性［6］。姜天麻为净天麻片经姜制的饮片，炮制目的是增强天麻止痛、抗眩晕之效［7］。张霞等［8］研究探讨了姜天麻炮制前后对硝酸甘油诱导的大鼠偏头痛的影响，认为天麻对硝酸甘油诱导的大鼠偏头痛作用，可能是通过降低一氧化氮（NO）、降钙素基因相关肽（CGRP）和提高血浆内皮素（ET）、多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）的含量，以改善偏头痛症状，且姜天麻较生品作用强，说明炮制后药效增强。陆平等［7］用HPLC法，以天麻素为含量指标，比较了姜天麻、生天麻、硫黄熏蒸天麻的含量，结果姜天麻中的天麻素含量相对较高，认为可能是天麻在姜制过程中，使得姜汁中的某些易溶出的成分加速了天麻素的溶出，提高了天麻素的溶出率。天麻质量评价的研究中，大多仅局限于天麻素的单成分分析，在对中药进行质量评价时，选择单一成分不能够全面反应中药质量。酚类化合物是天麻主要活性成分，天麻素和对羟基苯甲醇是天麻药材及含天麻中成药质量评价的指标成分［9］。姜天麻是《湖南省中药饮片炮制规范（2010年版）》［10］收载饮片品种。该标准中含量测定方法为HPLC 法测定天麻素的含量，为使姜天麻饮片质量得到更有效地控制，笔者用高效液相法，进行了姜天麻饮片中的天麻素和对羟基苯甲醇两种成分含量测定方法研究，建立了姜天麻的天麻素和对羟基苯甲醇的含量测定方法，为定量控制姜天麻质量提供了有效手段，现报告如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT 岛津高效液相色谱仪；检测器：SPDM20A；色谱柱：日本株式会社YMC HPLC Column C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，型号：HS12S05-2546WT）；电子天平：METTLER TOLEDO（型号AB135-S，十万分之一）；超声波清洗器（型号：KQ-200B，功率300 W，40 KHz）。

1.2 试药

姜天麻饮片5 批（湖南博世康中医药有限公司，批号201 911025；湖南然润堂中药有限公司，批号2019 112203；湖南衡岳中药饮片有限公司，批号19111228-1；湖南振兴中药有限公司，批号19112525-1；湖南三湘中药饮片有限公司2020060106）；天麻素对照品（中国食品药品检定研究院，含量测定用，批号：110807-202010，含量以95.5%计）；对羟基苯甲醇对照品（中国食品药品检定研究院，含量测定用，批号111970-201702，含量以99.4%计）。乙腈为色谱纯（批号2103542），水为超纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 液相色谱条件

色谱柱：YMC HPLC Column C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97）；流速：0.8 mL/min；检测波长为220 nm；柱温35 ℃。理论板数按天麻素峰计算，不低于5 000。进样量为5 µL。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液 取天麻素对照品、对羟基苯甲醇对照品各适量，精密称定，加乙腈-水（3∶97）混合溶液分别制成含天麻素196.539 μg/mL、对羟基苯甲醇512.407 μg/mL 对照品储备液。精密吸取天麻素对照品储备液（196.539 μg/mL）5 mL 及对羟基苯甲醇对照品储备液（512.407 μg/mL）1 mL 同置20 mL 容量瓶中，加乙腈-水（3∶97）混合溶液稀释至刻度，摇匀，即得含天麻素49.135 μg/mL、对羟基苯甲醇25.620 μg/mL 混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取本品粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取滤液10 mL，浓缩至近干无醇味，残渣加乙腈-水（3:97）混合溶液溶解，转移至25 mL 量瓶中，用乙腈-水（3∶97）混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 系统适用性试验

取混合对照品溶液、供试品溶液按上述色谱条件进样，记录色谱图，见下图1、图2。结果表明，混合对照溶液中天麻素与对羟基苯甲醇保留时间分别为13.795 min、23.536 min，样品中天麻素与对羟基苯甲醇保留时间分别为13.828 min、23.323 min,样品中其他成分对天麻素、对羟基苯甲醇的测定无干扰。样品中理论板数按天麻素峰计算为23 839，不低于5 000；样品中天麻素与前面的杂质峰分离度为2.373，对羟基苯甲醇与天麻素分离度为7.871，均大于1.5；天麻素与对羟基苯甲醇拖尾因子分别为1.04、0.97，均在0.95～1.05 之间；重复性实验：取混合对照品溶液，连续进样5 次，记录色谱峰面积，天麻素RSD=0.09%（n=5），对羟基苯甲醇RSD=0.22%（n=5），均不大于2.0%；说明系统适用性符合要求。

图1 天麻素、对羟基苯甲醇混合对照溶液HPLC色谱图

图2 供试品溶液HPLC色谱图

2.4 线性关系考察

精密称取天麻素对照品、对羟基苯甲醇对照品各适量，加乙腈-水（3:97）混合溶液分别制成天麻素对照品储备液（380.854 μg/mL）及对羟基苯甲醇对照品储备液（179.715 μg/mL）。

精密吸取天麻素对照品储备液，对羟基苯甲醇对照品储备液各适量加乙腈-水（3∶97）混合溶液依次稀释成为含天麻素浓度为152.341 6、114.256 2、76.170 8、47.606 8、23.803 4、9.521 4、0.952 1 μg/mL及含对羟基苯甲醇浓度为71.886 0、53.914 5、35.943 0、22.464 4、11.232 2、4.492 9、0.449 3 μg/mL 的混合对照品溶液。精密吸取上述系列混合对照品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定，以峰面积积分值为纵坐标，浓度为（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。天麻素回归方程为y=111 535x-643.18，r=0.999 9；对羟基苯甲醇回归方程为y=20 768x-3 212.7，r=0.999 9；结果表明天麻素和对羟基苯甲醇对照品分别在0.952 1～152.341 6 μg/mL 和0.449 3～71.886 0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

取同一姜天麻供试品溶液（湖南然润堂中药有限公司，批号2019102203），连续进样6 次，每次5 μL，记录色谱峰面积，计算天麻素RSD=1.37%（n=6），对羟基苯甲醇RSD=0.86%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一姜天麻供试品溶液（批号2019102203），分别于配制后的0、3、6、12、24 h，精密吸取5 μL，注入液相色谱仪，测定，结果：天麻素的RSD=1.06%，对羟基苯甲醇的RSD=1.52%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.7 重复性试验

取同一姜天麻供试品溶液（批号2019102203），依“2.2.2”项方法制备6 份供试品溶液，测定并按干燥品计算，结果：天麻素的含量平均值为0.30%，RSD 为0.67%；对羟基苯甲醇的含量平均值为0.09%，RSD 为2.35%。表明该方法重复性良好。

2.8 耐用性试验

分别用液相色谱仪（1）LC-20AT，色谱柱YMC C18（250mm×4.6mm×5 µm，编号HS12S05-2546WT，YMC 公司）和（2）Agilent 1260Ⅱ，色谱 柱Agilent C18（250mm ×4.6mm×5 µm，编 号588905-902，Agilent 公司），平行测定同一批号的3 份样品，结果3 份样品天麻素含量分别为：（1）0.30%、0.30%、0.30%；（2）0.29%、0.29%、0.29%。（1）与（2）测定的3 份含量结果之间的RSD 均为2.40%；对羟基苯甲醇含量分别为：（1）0.087%、0.087%、0.084%；（2）0.087%、0.085%、0.087%。（1）与（2）测定的3 份含量结果之间的RSD 分别为0%、1.64%、2.48%结果表明：本方法耐用性良好。

2.9 加样回收率试验

取已测定含量的同一姜天麻供试品溶液（批号2019102203，含水分10.12%，按干燥品计算含天麻素0.304 3%、对羟基苯甲醇0.086 %）约1 g（9 份），精密称定，置具塞锥形瓶中，按含量的80%、100%和120%左右的水平精密加入浓度为1 896.152 5 μg/mL 的天麻素对照品及浓度为1 015.868 5 μg/mL 对羟基苯甲醇对照品适量（所用量具为经校正的刻度吸管），见表1、表2，依“2.2.2”项方法制备供试品溶液，测定，计算含量。结果天麻素及对羟基苯甲醇平均加样回收率分别为99.18%、95.21%。RSD 分别为2.65%（n=9）、2.75%（n=9）表明本方法加样回收率良好。

表1 天麻素加样回收率试验结果表

表2 对羟基苯甲醇加样回收率试验结果表

2.10 样品含量测定

取姜天麻饮片5 批（批号：201911025、2019112203、19111228-1、19112525-1、2020060106），按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，进行测定，分别按外标两点法计算天麻素和对羟基苯甲醇的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果

3 讨论

采用HPLC 法或UPLC 法分析天麻和天麻饮片中成分的含量，研究报道较多，分析检测天麻中的成分有天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E、对羟基苯甲醇、原儿茶酸等［11-15］。在采用HPLC 法测定姜天麻中的主要成分含量的研究方面，报道较少［7］。《中国药典》2020 年版一部［1］天麻的标准中，天麻的含量测定成分为天麻素和对羟基苯甲醇。因此，本方法以姜天麻中的天麻素和对羟基苯甲醇作为含量测定成分。本实验建立的测定姜天麻饮片中的天麻素和对羟基苯甲醇含量的方法，快速，准确，高效，灵敏，为姜天麻的质量控制提供了有效的检测手段。